诱导剂对乳白耙齿菌产MnP活性影响研究

何 平,张 健,池玉杰

(东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040)

乳白耙齿菌(Irpexlacteus)又名白囊耙齿菌[1]，隶属于担子菌亚门(Basidiomycets)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、耙齿菌属(Irpex)[2]，它属于白腐菌的一种，一般生于阔叶树的枝条上[3]。研究显示白腐菌可以产生木质素过氧化物酶，漆酶和锰过氧化物酶，其中锰过氧化物酶[Manganese peroxidase (MnP)]，既可以氧化木质素中的酚类结构单元又可以氧化非酚类的结构单元，是一种高效的木质素降解酶[4]，而霉菌、细菌和酵母菌等都不产生锰过氧化物酶。据研究MnP不仅可以降解木材中的木质素应用于造纸业，还可以对染料等有毒酚类物质进行降解脱色并应用于工业废水治理，因此近些年来MnP被广泛应用及研究。而锰过氧化物酶是一种诱导酶类，其合成水平不仅与菌株本身的产酶能力密切相关，同时还受不同的培养条件[5-7]、特别是诱导剂的影响。而根据诱导途径的不同可将诱导剂分为3类，首先是易被代谢的底物，如果糖，葡萄糖等可以提供生长能源和电子来源的物质；其次是与降解底物有相似结构的物质，这些物质既是诱导底物，又是降解底物；第三种是酶结构有关的诱导物，可促进酶的产生，如Cu2+、Mn2+、血红素等。比如添加适量的金属离子Mn2+对大多数真菌MnP的产量有很大的诱导作用，因为Mn2+存在于MnP酶蛋白的活性位点上，会影响MnP基因的表达转录，所以也是MnP分泌的必要诱导剂。本研究检测了各种类型诱导剂对乳白耙齿菌的产MnP活性的作用，进一步完善了乳白耙齿菌液体培养的培养基配方，对完善乳白耙齿菌最优培养基，使Irpexlacteus高效产出MnP具有重要意义，为造纸工业中生物制浆技术的进一步研究应用及环境中有害物质的降解等问题的解决提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种来源、培养基与菌种复壮

本研究中试验菌种乳白耙齿菌(Irpexlacteus)由东北林业大学林学院森林保护学科森林病虫病理实验室提供，试验前菌种保存在Potato Dextrose Agar (PDA) 培养基斜面上，冷藏于4 ℃ 冰箱中。

取出保存在PDA斜面培养基上的乳白耙齿菌(Irpexlacteus)，在室温下静置24 h后，转接入新的PDA平板培养基上，在28 ℃下培养，6 d左右菌丝长满整个平板。此时菌种的生长势最旺盛，作为后续试验供试菌株。

1.2 初始Irpex lacteus产MnP活性的测定

将生长在PDA培养基6 d的Irpexlacteus菌株转接入产酶培养基中。在产酶培养基中分别培养5，7，9，11，13，15，17，20 d时提取酶液，测定MnP活性。

产酶培养基(L-1)：葡萄糖10 g，酒石酸铵6 mmol，MnSO4·H2O 0.030 5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.01 g,KH2PO40.2 g，吐温80 1 mL，矿物元素溶液(L-1):Ferric-citrate·H2O 0.087 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g,MnSO4·H2O 0.45 g,CoCl2·6H2O 0.1 g,CuSO4·5H2O 0.01 g 10 mL，维生素溶液(L-1):D-biotin 0.002 g,Folic acid 0.002 g,Thiamine·HCl 0.005 g,Riboflavin 0.005 g,Pyridoxine·HCl 0.01 g,Cyanocobalamin 0.000 1 g,Nicotinic acid 0.005,Calsium Pantothenate 0.005,P-aminobenzoic acid 0.005,DL-6,8-thioctic acid 0.005)1 mL,pH值为7。

MnP活性测定方法，在37 ℃条件下，测定体系1 mL,其中pH=4.5的丙二酸钠缓冲液(50 mmol/L) 840 μL，MgSO4溶液(10 mmol/L) 50 μL，2,6-DMP溶液(10 mmol/L) 50 μL，待测酶液50 μL，H2O2溶液(10 mmol/L) 10 μL，以1 mL去离子水作为对照，测定470 nm处吸光度在1 min内的变化值。上述条件下，每分钟催化1 μmol 2,6-DMP所需的酶量。酶活计算公式如下：MnP活力=[106×V1×ΔA×N]/[V2×ε470×Δt]。计算中ε470=49 600[(mol/L)·cm]-1。

1.3 诱导剂对锰过氧化物酶活性的诱导

1.3.1 单独诱导剂的初筛选试验 参考相关文献[10-14]，本研究共选择12种2大类诱导剂作为Irpexlacteus产MnP的诱导剂，其中生物诱导剂2种：麦麸和木屑；化学诱导剂10种：愈创木酚、苯酚、香兰素、藜芦醇、苯甲酸、没食子酸、酪氨酸、二甲苯、苯胺蓝和ABTS。麦麸和木屑的添加量均为1.5%，在初始配制产酶培养基时加入；其他化学诱导剂配制成高浓度母液过滤除菌，在Irpexlacteus在初始产酶培养基中培养的第3天时加入，使诱导剂添加的终浓度均为0.5 mmol/L。以不加诱导剂的初始产酶培养基培养的菌液为对照，每组重复3次，隔天测定MnP活性，获得各单项诱导剂的MnP活性曲线，进而初步筛选出对Irpexlacteus产MnP诱导效果好的生物和化学诱导剂。

1.3.2 诱导剂浓度单因素试验 根据各单项诱导剂的诱导结果，筛选出诱导Irpexlacteus产MnP活性较高的诱导剂，进行最佳诱导剂的不同浓度单因素试验，测定MnP活性，以确定该诱导剂的最适添加量。

1.3.3 诱导剂组合及Mn2+浓度对Irpexlacteus产MnP活性的影响 测定两种最佳诱导剂在最适浓度下，同时添加时对Irpexlacteus产MnP活性的影响，确定诱导剂组合效果是否优于单项诱导剂诱导MnP的产生。

再添加最佳诱导剂组合的基础上改变Mn2+浓度，检测MnP活性，确定Mn2+最适添加量。综合分析最优产酶培养基配方。

2 结果与分析

2.1 初始Irpex lacteus产锰过氧化物酶活性的测定

图1 Irpex lacteus产MnP活性Fig.1 MnP activity of Irpex lacteus

在初始产酶培养基的条件下，检测了在初始产酶培养基中Irpexlacteus的MnP活性，得到的结果(图1)所示可以看出，Irpexlacteus产MnP活性在第5天到第7天急剧上升，最高峰在第7天时出现此时MnP活性为12.7 U/L，MnP活性由1.81 U/L急剧上升至12.7 U/L上涨约7倍，第7天到第9天MnP活性急剧下降，在第9天到第20天期间MnP活性变化趋于平稳在3.7 U/L至5.8 U/L之间浮动。

1：麦麸；2：木屑；3：愈创木酚；4：苯酚；5：香兰素；6：藜芦醇；7：苯甲酸；8：没食子酸；9：酪氨酸；10：二甲苯；11：苯胺蓝；12：ABTS；13：对照组1:wheat bran;2:sawdust;3:guaiacol;4:phenol;5:vanillin;6:veratryl alcohol;7:benzoic acid;8:gallic acid;9:tyrosine;10:xylene;11:aniline blue;12:ABTS;13:control group图2 17 d时诱导剂对锰过氧化物酶活性的影响Fig.2 Effect of 17-day inducer on manganese peroxidase activity

2.2 诱导剂的筛选试验

本试验所选择的12种诱导剂对Irpexlacteus产MnP活性的诱导效果不同，通过隔天测定各MnP活性的方式分析各诱导剂效果，从表1可以确定第17天为诱导剂诱导Irpexlacteus产MnP高峰。12种诱导剂在第17天时对诱导Irpexlacteus产MnP活性的诱导结果(图2)可以看出，化学诱导剂中ABTS的诱导效果最好，此时MnP的酶活为145.161 U/L，是在初始产酶培养基中对照培养酶活(13.306 U/L)的11倍；其次为没食子酸，是对照酶活的5.6倍。其他诱导剂的诱导效果一般。对于2种生物诱导剂麦麸和木屑来说，产酶高峰为13 d，在13 d时酶活分别为104.234 U/L、48.992 U/L，分别是对照酶活的8.6倍、4.1倍，可见麦麸的诱导效果优于木屑。根据以上结果选择出对乳白耙齿菌锰过氧化物酶活性的诱导较好的诱导剂为麦麸、ABTS和没食子酸。

2.3 诱导剂浓度单因素试验

通过单项诱导剂的筛选，选择了诱导效果最好的生物诱导剂麦麸和化学诱导剂的ABTS，进行最佳诱导剂不同浓度的单因素试验，以确定该诱导剂的最适添加量。麦麸添加量设置3个浓度梯度，分别为1%、1.5%和2%，化学诱导剂ABTS的添加量设置了共6个浓度梯度，分别为0.05，0.2，0.5，1，1.5，2 mmol/L，以不加诱导剂的初始产酶培养基培养的菌液为对照，每组重复3次，隔天测定锰MnP活性，分别得到了不同浓度的麦麸和ABTS对Irpexlacteus产MnP活性的诱导结果。从表2看出除浓度为1.5 mmol/L和2.0 mmol/L麦麸培养的产酶高峰为第13天和第15天外，其他浓度的ABTS在第19天时对MnP的诱导效果都达到最好，而且MnP活性平均值均高过浓度为1.5 mmol/L和2.0 mmol/L时。麦麸培养的产酶高峰均出现在第13天，图3显示了不同浓度的ABTS在第19天时对锰过氧化物酶的诱导结果，图4显示了不同浓度的麦麸在第13天时对锰过氧化物酶的诱导结果。

表1 12种诱导剂对锰过氧化物酶活性的影响

表2 麦麸和ABTS浓度对锰过氧化物酶活性的影响

由图3可知，不加ABTS，MnP的活性很低；加入少量的ABTS(0.05 mmol/L)，MnP的活性显著提高，也表明了ABTS对MnP的显著诱导能力，当ABTS浓度为0.2 mmol/L时诱导的MnP活性达到最高，酶活为193.347 U/L，是对照酶活的14.5倍，高过了1.5%的麦麸对MnP的诱导效果，但ABTS浓度增加到0.5 mmol/L时，MnP的活性就开始下降了，说明过高浓度的ABTS不利于菌体产生MnP，同时也说明过高浓度ABTS对菌丝体也有毒害作用。由图4可以看出，不加麦麸，MnP的活性很低；加入1%的麦麸，MnP的活性显著提高，表明麦麸对MnP有显著诱导能力，麦麸含量为1.5%培养时间为13 d时，MnP的酶活性最高，为99.395 U/L；但麦麸含量升高到2%时，MnP的活性又下降，可能是麦麸含量过高影响了培养基中的含氧量，导致菌体生长欠佳，不利于MnP的合成。

图3 ABTS浓度对锰过氧化物酶活性的影响Fig.3 Effect of ABTS concentration on manganese peroxidase activity

图4 麦麸含量对锰过氧化物酶活性的影响Fig.4 Effect of wheat bran content on manganese peroxidase activity

2.4 Mn2+浓度及诱导剂组合对Irpex lacteus产MnP活性的影响

在不加Mn2+和添加0.2 mmol/L Mn2+的情况下，分别检测了麦麸和ABTS 2种最佳诱导剂在最适浓度下单独添加和同时添加时Irpexlacteus的MnP活性，发现两种诱导剂组合的情况下，Irpexlacteus的产酶高峰变为第17天，在第17天的酶活结果如图5所示，从图中可以看出：无论是否添加Mn2+，同时添加麦麸和ABTS 2种诱导剂，比单独添加其中1种诱导剂的MnP活性高，即麦麸和ABTS这2种诱导剂组合的诱导效果优于任何1个单项诱导剂；在含有0.2 mmol/L Mn2+的情况下，无论是单项诱导剂还是2种诱导剂组合，都比不添加Mn2+的诱导效果更好，最高的锰过氧化物酶活性出现在含有0.2 mmol/L Mn2+，同时添加1.5%麦麸和0.2 mmol/L ABTS时，此时锰过氧化物酶活性为203.226 U/L，是对照酶活的21.9倍。因此确定同时添加Mn2+和1.5%麦麸和0.2 mmol/L ABTS为最佳诱导剂组合。

图6显示了在培养液内添加最佳诱导剂组合的同时，添加不同浓度Mn2+的MnP活性在17 d时的变化情况。Mn2+的浓度设置了6个浓度梯度，分别为0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，3.0 mmol/L。结果表明Mn2+的浓度不同，锰过氧化物酶的活性也不同，基本上是低浓度促进，较高浓度对产酶也有促进作用，但效率降低。当Mn2+浓度在0～0.2 mmol/L期间时锰过氧化物酶活性随Mn2+浓度增加而增加，在0.2 mmol/L时活性达到最高，Mn2+浓度超过0.2 mmol/L后活性随Mn2+浓度增加而逐渐下降，但比不加Mn2+的对照组时酶活性高，分析原因是Mn2+为重金属离子，过高Mn2+浓度对菌体有毒性，对菌体的生长产生抑制作用，同时也抑制了菌体对锰过氧化物酶的分泌。

图5 2种诱导剂组合对MnP活性的影响Fig.5 Effect of two inducers on MnP activity

图6 Mn2+浓度对MnP活性的影响Fig.6 Effect of Mn2 + concentration on MnP activity

3 结论与讨论

在乳白耙齿菌产MnP的过程中，加入一些与木质素结构相似的化合物做为诱导剂，如酚类或者芳香族化合物能大大提高MnP的产量，诱导剂的种类和添加量对MnP活性都有显著影响[11]。因此，诱导剂及用量的选择是MnP优化工艺中非常关键的步骤而不可或缺。本实验共选择12种底物作为白腐菌乳白耙齿菌(Irpexlacteus)产MnP的诱导剂，进行了单项诱导剂的筛选试验、最佳单项诱导剂浓度的单因素试验，2种最佳诱导剂组合、Mn2+浓度对MnP活性的影响试验等，通过逐级筛选结果表明：在初始产酶培养基中加入0.2 mmol/L Mn2+的情况下，生物诱导剂麦麸和化学诱导剂ABTS诱导的Irpexlacteus产MnP酶活高、效果好，在初始产酶培养基中静置培养Irpexlacteus分别加入1.5%的麦麸和0.2 mmol/L的ABTS，在产酶高峰时MnP酶活分别是初始产酶培养基培养Irpexlacteus酶活的8.6倍和11倍；而这两种最佳诱导剂在最适浓度下组合的诱导效果又优于使用任何一种单项诱导剂，即同时添加1.5%麦麸与0.2 mmol/L ABTS诱导剂效果更好，在28 ℃静置培养的条件下，酶活峰值可达203.226 U/L，是初始培养条件锰过氧化物酶活性的21.9倍，表明诱导剂能大幅度地提高Irpexlacteus的锰过氧化物酶活性。因此，得出乳白耙齿菌Irpexlacteus产锰过氧化物酶的最适条件：在100 mL三角瓶中加入初始产酶培养基30 mL，其中添加1.5%麦麸，接入3块直径9 mm的菌饼，在28 ℃下静置培养培养3 d后，再添加0.2 mmol/L的Mn2+和0.2 mmol/L的ABTS，继续在28 ℃下静置培养17 d达到其产酶高峰。此时锰过氧化物酶活性为203.226 U/L，是对照酶活的21.9倍。王忠艳等[15]对乳白耙齿菌最佳培养及配方进行了优化研究，杨晓宽等[16]对白腐菌产锰过氧化物酶培养基的优化做了研究，本文在该研究的基础上进行诱导剂实验，使MnP的活性得到了提高，表明乳白耙齿菌(Irpexlacteus)所产得MnP是一种诱导型酶，其合成不仅易受培养条件的影响，更受到诱导剂的影响，适宜的诱导剂能大幅度地提高乳白耙齿菌(Irpexlacteus)的MnP活性。