红曲霉菌体残渣酶解条件优化研究

周红姿，李纪顺，刘 新，吴远征，赵吉兴，李 耀

（1.山东省科学院生物技术研究中心，山东省应用微生物重点实验室，山东济南250014；2.山东省科学院生物所，山东济南250014；3.山东中惠生物科技股份有限公司，山东滨州251707)

红曲霉菌体残渣酶解条件优化研究

周红姿1，李纪顺1*，刘 新2，吴远征1，赵吉兴3，李 耀3

（1.山东省科学院生物技术研究中心，山东省应用微生物重点实验室，山东济南250014；2.山东省科学院生物所，山东济南250014；3.山东中惠生物科技股份有限公司，山东滨州251707)

为提高红曲霉菌（Monascus purpureus）体残渣的利用率，采用机械破壁和酶解结合方法释放胞内蛋白。细胞破碎液经纤维素酶与复合酶联合处理，通过正交试验确定最佳的水解条件为红曲霉菌体残渣质量浓度60 g/L、酸性纤维素酶用量1.0%、复合酶用量0.5%、水解时间36 h。在此条件下，红曲霉菌体残渣的失重率达到27.86%，总糖含量达到7.38 g/L，小肽含量达到83.95 mg/g，游离氨基酸含量达到22.31 mg/g。

红曲霉菌；纤维素酶；复合酶；总糖；小肽；游离氨基酸

红曲以籼米为原料，采用现代生物工程技术分离出优质的红曲霉菌（Monascus purpureus）经液体深层发酵精制而成，是一种纯天然、安全性高、有益于人体健康的食品添加剂。采用红曲霉制备红曲的历史悠久，在发酵培养过程中能产生大量红曲色素[1-3]，此外还能产生多种次级代谢产物，如莫纳可林K、洛伐他汀、几丁质酶、辅酶Q10等，因此红曲具有降胆固醇、降血压、降血糖以及预防冠心病和治疗骨质疏松疾病等功能[4-7]。我国很多企业利用红曲霉进行工业化生产红曲色素，浸提色素后，形成大量红曲霉菌体残渣（以下简称菌渣），富含蛋白质和活性物质，现主要应用于生产蛋白饲料，但其中很多大分子活性物质不利于人畜吸收，目前对菌渣酶解前后营养成分的变化规律研究很少，本试验在前人研究基础上[8-10]，研究其酶解前后营养成分变化规律，采用机械破碎和纤维素酶结合方法释放出多糖及菌体内蛋白，通过酶解将这些大分子物质降解成小分子，提升菌渣的营养品质，提高其利用率，为使菌渣得到高效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌渣：山东中惠生物科技股份有限公司；酸性纤维素酶（100 000 U/g）：山东隆大生物工程有限公司；诺维信纤维素酶（100 U/g）：诺维信中国投资有限公司；和氏璧纤维素酶（100 000 U/g）、复合酶（中性蛋白酶60 000 U/g、β-葡聚糖酶2 000 U/g、纤维素酶30 000 U/g）：和氏璧生物技术有限公司；D-葡萄糖标准品（纯度≥98%）：大连美仑生物技术有限公司；苯酚（分析纯）、三氯乙酸、三氟乙酸（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸（分析纯）：莱阳市铁塔化工制品厂；甲醇（色谱纯）：美国Fisher公司。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-60SII立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HZQ-Q全温振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；Agilent 1260 Infinity液相色谱仪：美国Agilent公司；KQ-400KDE超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；细胞型1820D Molecular超纯水仪：重庆摩尔水处理设备有限公司；TU-1810紫外可见光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；FA1004N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；HITACHI CR22GⅢ型离心机、L-8900氨基酸分析仪：日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 菌渣破碎前处理

菌渣粉碎后，过100目筛，获得菌渣粉备用。

1.3.2 菌渣粉中粗蛋白及氨基酸含量的测定

凯氏定氮法[11]检测菌渣粉的粗蛋白含量；氨基酸测定仪检测菌渣粉中氨基酸含量。

1.3.3 菌体细胞破碎与酶解水解菌渣蛋白

称量适量菌渣粉，加入蒸馏水在低温条件下溶胀16 h，胶体磨研磨80 min，并在121℃灭菌30 min，待其凉后按照产品推荐量分别加入1%酸性纤维素酶、1%和氏璧纤维素酶、3%诺维信纤维素酶，混匀，置于37℃、160 r/min条件下酶解24 h，再分别在无菌条件下加入0.5%复合酶，37℃、160 r/min条件下继续酶解24 h后，将水解液6 000×g离心10 min，收集菌渣，烘干至质量恒定后测定菌渣失重率，以失重率反映菌渣蛋白水解程度，其计算公式：

1.3.4 正交试验设计

根据前期预试验，采用L9（34）正交试验，选取菌渣质量浓度（A）、酸性纤维素酶添加量（B）、复合酶添加量（C）和水解时间（D）这四个因素作为考察因素，以菌渣失重率为评价指标，考察酶解条件对菌渣失重率的影响。每个因素取3个水平。每个处理设3个重复。正交试验因素与水平见表1。

1.3.5 菌渣水解液总糖检测

葡萄糖标准曲线的制作：精密称取105℃干燥至恒质量的D-葡萄糖标准品200.000 mg，加适量水溶解并定容至100 mL容量瓶中，摇匀，配成质量浓度为2.00 mg/mL的葡萄糖标准液。分别吸取葡萄糖标准溶液0.1 mL、0.2 mL、 0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL至15 mL具塞试管中，加蒸馏水补足至1 mL，加入5%苯酚溶液0.6 mL，摇匀，再迅速加入3 mL浓硫酸，摇匀，沸水浴中加热显色反应15 min，迅速冷却至室温。另以蒸馏水1 mL同上操作加苯酚和硫酸进行显色反应，作为空白对照。在最大吸收波长489 nm处测定吸光度值，以质量浓度为横坐标（x），以吸光度值为纵坐标（y），进行线性回归。

苯酚-硫酸比色法测定菌渣水解液中总糖含量[12]：精密量取菌渣水解液0.2mL，取蒸馏水稀释并定容至50 mL容量瓶中，精确量取供试液1 mL于具塞试管中，加入5%苯酚溶液0.6mL，摇匀，再迅速加入3mL浓硫酸，摇匀，沸水浴中加热显色反应15 min，取出后迅速冷却至室温，以蒸馏水作为空白对照，于波长489 nm处测定吸光度值。根据回归方程，计算得到葡萄糖含量，以葡萄糖计水解液中总糖含量。

1.3.6 菌渣水解液高效液相色谱检测小分子化合物

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪检测小分子化合物。色谱条件：色谱柱ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm× 5 μm），流动相A为体积分数为1%三氟乙酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0～5 min，5%B；5～45 min，5%～100%B；45～55 min，100%B；55～56 min，100%～5%B。检测器是二极管阵列（diodearraydetector，DAD）检测器，检测波长270 nm，柱温30℃，流速1.0 mL/min，分析时间58 min；系统平衡色谱柱时间为15 min。

1.3.7 菌渣及菌渣水解液中小肽含量和总游离氨基酸含量检测

总游离氨基酸含量测定[13]：取5mL样品上清液于10mL试管中，准确加入5 mL 5%三氟乙酸溶液，混匀，于4℃7 000×g离心20 min，用0.45 μm的无机滤膜过滤。吸取滤液20 μL待测液注入L-8900全自动氨基酸分析仪，采用外标法定量测定。

取适量菌渣水溶液及水解液，等体积加入10%三氯乙酸，在160 r/min摇床上振荡30 min，4 000×g离心10 min，各取上清液10 mL于消化管中，按测定粗蛋白质方法消化、定容至100 mL。移取10 mL消化液蒸馏，测定菌渣水溶液及水解液中粗蛋白质含量。同时以蒸馏水作为空白。

氨基酸态氮含量[14]：依据GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》中的甲醛值法进行测定。

小肽含量=粗蛋白含量－氨基酸态氮含量

2 结果与分析

2.1 菌渣粉中氨基酸含量和蛋白测定

凯氏定氮法检测菌渣粉的蛋白含量为38.41%。菌渣粉中氨基酸含量检测结果见表2。

由表2可知，菌渣粉中的蛋白质含有17种氨基酸，氨基酸总含量占菌渣的21.90%，其中必需氨基酸占氨基酸总含量的37.20%，说明菌渣粉有较好的营养价值。

2.2 不同纤维素酶水解菌渣蛋白

菌渣溶液灭菌后，分别加入1%酸性纤维素酶、1%和氏璧纤维素酶及3%诺维信纤维素酶，混匀，置于37℃、160r/min条件下酶解24 h，再分别在无菌条件下加入0.5%复合酶，37℃、160 r/min条件下继续酶解24 h后，将水解液6 000×g离心10 min，收集菌渣，烘干至质量恒定后测定菌渣失重率，结果见图1。

由图1可以看出，经纤维素酶、复合酶处理的样品，菌渣失重率差异明显，其中酸性纤维素酶的处理失重率最高，达16.72%，诺维信纤维素酶处理其次，为15.58%，和氏璧纤维素酶处理最低，为14.42%，因此后续试验均采用酸性纤维素酶联合复合酶共同水解菌渣。

2.3 酶解条件优化正交试验

本试验选取菌渣质量浓度（A）、酸性纤维素酶添加量（B）、复合酶添加量（C）和水解时间（D）为考察因素，以菌渣失重率作为试验考察指标，正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。

由表3可知，4因素对菌渣失重率的影响作用大小依次为C＞A＞D＞B，即复合酶添加量＞菌渣质量浓度＞水解时间＞酸性纤维素酶添加量。最佳水平组合为A2B3C2D2，即最佳优化组合为菌渣质量浓度60 g/L、酸性纤维素酶添加量1.0%、复合酶添加量0.5%、水解时间36 h。在此最佳条件下进行验证试验，重复3次，平均失重率27.86%。

由表4可知，A、C、D因素对结果影响差异显著（P＜0.05），B因素对结果影响差异不显著（P＜0.05）。

2.4 菌渣水解液总糖检测

2.4.1 葡萄糖标准曲线的建立

在最大吸收波长489 nm处测定吸光度值，以葡萄糖质量浓度为横坐标（x），以吸光度值为纵坐标（y），绘制葡萄糖标准曲线见图2。标准曲线线性回归方程：y=1.607 5x，相关系数R2=0.991 8。结果表明，葡萄糖在0～2 mg/mL与吸光度值之间呈良好的线性关系。

2.4.2 菌渣水解液总糖测定

按照苯酚-硫酸比色法检测菌渣粗粉碎60 g/L水溶液中总糖（以葡萄糖计）含量为0.73 g/L，在最佳条件下60 g/L菌渣水解液中的总糖（以葡萄糖计）含量为7.38 g/L，酶解后总糖含量提高了10倍。

2.5 液相色谱检测菌渣水解液小分子化合物组分

取菌渣溶液（作为对照）和最佳条件下水解液的上清液进行高效液相色谱检测，结果见图3。

由图3可知，最佳条件下菌渣水解液中的小分子化合物组分比对照中的发生了明显变化，在保留时间较小的时间范围内，小分子化合物组分种类明显增多，而在保留时间较大的时间范围里的种类有所减少，总体上，最佳条件下菌渣水解液中的小分子化合物组分种类明显增多，说明经过水解后菌渣中的组分发生了明显变化，其中很多大分子物质被降解成更易于吸收的小分子化合物。

2.6 最佳条件下菌渣水解液中小肽含量和总游离氨基酸检测

在此最佳优化组合下进行试验，取水解液进行小肽含量检测，发现小肽含量达最大值83.95mg/g干料，而水解前菌渣粉中小肽含量为0.72 mg/g干料，说明菌渣经过酶解后，蛋白被降解成小肽，更有益于人畜吸收，提升了菌渣的营养品质。

氨基酸本身呈现出酸、甜、苦、鲜等各种味道，甜味类氨基酸有甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸，鲜味类氨基酸有谷氨酸和天冬氨酸，呈苦味氨基酸有酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸[15]。由表5可知，从水解液中共检出16种游离氨基酸，总游离氨基酸含量最高达到22.31 mg/g干料，占菌渣水解液氨基酸组成的10.19%，其中必需氨基酸量达到13.28 mg/g干料，占菌渣水解液氨基酸组成6.06%。呈鲜味的天门冬氨酸占总游离氨基酸量的0.67%，呈甜味的氨基酸（丝氨酸、脯氨酸）占总游离氨基酸含量的1.43%，使水解液散发出香甜味，有助于提高人的食欲。

3 结论

红曲菌体残渣是生产红曲色素形成的下脚料，其中含有大量的纤维素等大分子化合物，蛋白含量高达38.41%，目前主要用于生产动物的蛋白饲料，但其中蛋白质分子较大，大部分为胞内蛋白，残渣中游离氨基酸的含量极低，不易于被人畜充分吸收。通过细胞破碎结合纤维素酶水解，可将残渣中的纤维素等大分子化合物降解为人畜易消化利用的养分，同时释放胞内蛋白，并在复合酶作用下，菌渣的大分子蛋白被降解为小分子蛋白、小肽及游离氨基酸。结果表明，菌渣质量浓度、复合酶添加量、反应时间均对蛋白水解有显著影响，最佳酶解条件为菌渣质量浓度为60g/L、酸性纤维素酶添加量为1.0%、复合酶添加量为0.5%、水解时间为36h。在此最佳条件下，菌渣蛋白的失重率可达27.86%，总糖含量达到7.38 g/L，通过高效液相色谱检测，发现水解液中的小分子化合物组成明显增多，水解液小肽含量达到83.95 mg/g，游离氨基酸含量达到22.31 mg/g。

菌渣经过处理后，大分子物质含量降低，可溶性蛋白、小肽、游离氨基酸及可溶性总糖含量大大提高，有利于人畜的吸收，提高消化吸收率，改善适口性，使其品质得到一定程度的提升，提高了菌渣的综合利用率，为将其开发成高营养价值的保健产品提供了理论参考。

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Optimization of enzymatic hydrolysis of the residue fromMonascus purpureus

ZHOU Hongzi1,LI Jishun1*,LIU Xin2,WU Yuanzheng1,ZHAO Jixing3,LI Yao3
(1.Biotechnology Center of Shandong Academy of Sciences,Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Jinan 250014,China;2.Biology Institute of Shandong Academy of Sciences,Jinan 250014,China; 3.Shandong Zhonghui Biotechnology Co.,Ltd.,Binzhou 251707,China)

In order to improve the utilization rate of the residue fromMonascus purpureus,mechanical wall-breaking method combined with cellulase was used to release the intracellular protein.The wall-breaking liquid was treated by acid cellulase and compound enzymes.Through orthogonal test, the optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows:M.purpureusresidue concentration 60 g/L,acid cellulase 1.0%,compound enzyme 0.5%,and reaction time 36 h.Under these conditions,the weight-loss rate of the residue was 27.86%,the total sugar content was up to 7.38 g/L,the peptide content was up to 83.95 mg/g,and the free amino acid content was up to 22.31 mg/g.

Monascus purpureus;cellulase;compound enzyme;total sugar;peptide;free amino acid

TQ920.1

A

0254-5071（2015）06-0048-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.011

2015-05-04

山东省科技发展计划（2014GSF121035）

周红姿（1976-），女，副研究员，硕士，研究方向为应用微生物。

*通讯作者：李纪顺（1971-），男，高级工程师，本科，研究方向为应用微生物。