离子束诱变与连续驯化选育耐毒性产丁醇菌株

金超楠，刘 莉，史吉平，孙庆元

（1.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034；2.中国科学院上海高等研究院，上海201210）

离子束诱变与连续驯化选育耐毒性产丁醇菌株

金超楠1，2，刘 莉2，史吉平2，孙庆元1*

（1.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034；2.中国科学院上海高等研究院，上海201210）

利用离子束注入的方法对丁醇发酵菌株拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NCIMB 8052进行诱变，筛选得到了突变株拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CN18，相对于出发菌株，该突变株的丁醇产量从9.9 g/L增加至12.8 g/L，提高了29.3%；总溶剂产量从13.4 g/L增加至18.2 g/L，提高了35.8%。该突变菌株连续传代20次，溶剂产量稳定，菌株无明显退化。使用含木质素降解产物的培养基对该菌株进行连续培养驯化，最终获得一株耐木质素降解产物的高产突变株，命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CN88，其耐受木质素降解产物的质量浓度提高至1.0 g/L。在0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L的抑制物质量浓度下发酵，可分别产总溶剂15.2 g/L、14.4 g/L、12.7 g/L。

拜氏梭菌；离子束诱变；连续培养；抑制物；遗传稳定性

石油等能源危机促使人们寻求新型能源来代替传统的化石燃料。生物质能源是最具潜力的可替代能源之一，其中，丁醇作为第二代生物质能源，展现了更多应用上的优势，在许多国家中已经进行了代替燃料用油的实验计划[1-3]。利用生物质原料生产丁醇一般要经过三步，即预处理、酶解、发酵[4]。由于菌种无法耐受木质纤维素降解单体的抑制作用，导致菌体生长受到严重抑制，最终导致溶剂产量很低，成为了广泛推广应用的瓶颈[5-6]，因此寻找和选育的高产耐毒菌株是必要的[7]。

目前对于菌种改造主要有两种方法：（1）基因工程菌的构建[8]，（2）传统的诱变方法[9-10]。低能量的离子束注入诱变技术在1991年第一次应用于大米育种[11]。这种诱变方法有很多优势，如低损伤率、高诱变率、更广泛的光谱范围等[12]。可利用此种诱变方法提高出发菌株对于木质素单体抑制物的耐受性，同时保证菌种高产。另外，可以通过菌种驯化方法来进一步提升其耐丁醇和木质素单体的毒性以及丁醇的生产能力[13-14]。

该实验利用离子束注入方法诱变出发菌株拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NCIMB 8052，并结合连续培养的驯化方式，对菌种进行进一步改造，从而获得耐木质素降解产物的高产丁醇突变株，为开发直接利用生物质酶解液而不经过脱毒步骤的发酵方法奠定了基础，相关的研究结果也对生物质转化和利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

本实验所使用的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NCIMB 8052，购于美国菌种保藏中心。

1.1.2培养基

TYA种子培养基：葡萄糖40.0 g，酵母粉2.0 g，蛋白胨6.0 g，牛肉粉2.0 g，NH4AC 3.0 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，K2HPO40.50 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸馏水定容至1 L，自然pH值，115℃灭菌15 min。

发酵培养基：葡萄糖50.0 g，其他同TYA种子培养基。

选择培养基：发酵培养基中加入等量的各种混合抑制物（对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、丁香酸、丁香醛、香草酸、香草醛、香豆酸以及阿魏酸），配制成含不同总质量浓度抑制物的一系列选择培养基（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L）。

1.1.3 化学试剂

葡糖糖、酵母粉、蛋白胨、琼脂、正丁醇、NH4AC、MgSO4·7H2O、K2HPO4、FeSO4·7H2O、牛肉粉、木糖、甘油等化学试剂均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；正丁醇、乙醇、丙酮、甲酸、乙酸均为色谱纯：美国Sigma试剂公司。

1.2 仪器与设备

离子束诱变台：济南杰康设备净化厂；LC-20A高效液相色谱仪、GC-2010plus高效气相色谱仪：日本SHIMADZU公司；MDF-U53V-80℃超低温冰箱：日本三洋公司；AW400SG厌氧培养箱：英国依莱泰科公司。

1.3 方法

1.3.1 种子培养

从-80℃冰箱取出种子，置于冰上融化后转接到含10 mL种子培养基的试管中，在沸水中热激1.0 min，迅速放入冷水中使之冷却，37℃恒温培养箱中静置培养24 h，然后按10%的接种量转入含有40 mL种子培养基的100 mL三角瓶，在37℃恒温培养箱中静置培养24 h后用于实验。

1.3.2 低能N+离子束注入诱变

将培养24 h的二级种子离心去上清液，加入等量的生理盐水洗涤，再次离心去上清液后用等量的培养基悬浮菌体，放入含有玻璃珠的100 mL三角瓶中打匀，使菌落的个数大约在108个/mL，取5 mL菌液放入玻璃培养皿中，再用过膜的无菌空气将其干燥，制造出干膜细胞。接下来放到诱变仪器的托盘上，分别用10 keV能量的范围为0、2×1014N+/cm2、4×1014N+/cm2、6×1014N+/cm2、8×1014N+/cm2、10×1014N+/cm2的离子束剂量对菌体进行诱变，整个过程的操作均在真空环境下进行（10-3Pa），时长55 s，脉冲5 s。然后将菌液稀释不同的梯度进行涂布，进行平板培养，避光放置于厌氧培养箱中培养24 h，进行菌落计数，计算致死率（存活率=1-致死率），确定最佳的离子束诱变剂量[15]。

1.3.3 遗传稳定性实验

将筛选得到的菌株在液体TYA培养基中连续传代20次，37℃静置培养48 h，气相色谱（gas chromatography，GC）法测定溶剂产量，每代做2个平行。

1.3.4 连续培养驯化

将培养到对数生长期的菌液按照1∶10的比例接种到连续培养系统（500 mL，密闭），此时的选择培养基含抑制物质量浓度为0.6 g/L。24 h后开始进行连续发酵培养，补料速度为10 mL/h。每隔24 h取样，通过测量发酵液的OD600nm值和pH值来指示菌体在培养基中的生长和代谢情况。连续驯化过程中，每隔5 d提升一次进料培养基的抑制物质量浓度（每次提升0.2 g/L），直至菌体无法耐受导致死亡，以此来达到驯化菌体耐毒性的目的。

1.3.5 发酵液溶剂及有机酸的测定方法

气相色谱仪Shimadzu 2010 Plus测定丁醇、丙酮、乙醇及乙酸、丁酸的含量。色谱条件：毛细管色谱柱Inert Cap Pure Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温：50℃保持3.8 min，以20℃/min升至220℃，保持3 min；进样口温度200℃，火焰离子检测器（flame ionization detector，FID）温度230℃；载气N2流速1.0 mL/min，H2流速40.0 mL/min；空气流速400.0 mL/min；进样量0.5 μL；分流比50∶1。采用内标法定量，内标物为异丁醇。

2 结果与分析

2.1 低能N+离子束注入诱变

分别用10 keV能量的范围为0、2×1014N+/cm2、4×1014N+/cm2、6×1014N+/cm2、8×1014N+/cm2、10×1014N+/cm2的离子束剂量对菌体进行诱变，结果见图1。

由图1可知，不同诱变剂量下菌体的存活率（存活率= 1-致死率）在6×1014N+/cm2时恰好形成一个“马鞍型”曲线，一般认为80%的菌体致死率是诱变的最佳结果，因此马鞍处的20%存活率剂量即为最适的诱变剂量。此时的诱变可以达到最高效率，既使得菌体死亡数多，又使得存活下来的菌体数量足够且生命力强。因此选择6×1014N+/cm2的离子束剂量参数下对出发菌株进行多轮诱变。

2.2 遗传稳定性实验

经最佳剂量多轮诱变处理后的菌液，经过24 h的中间避光富集培养，按1%的接种量转入种子培养基中培养，再将菌液涂布于固体TYA培养基上，在厌氧培养箱中培养36 h。挑选较大的菌落转接到TYA液体种子培养基，并转摇瓶发酵，以48 h为发酵终点，取样进行气相色谱测定。筛选丁醇产量高的菌株，获得产量最高的突变株，命名为拜氏梭菌（C.beijerinckii）CN18。

对突变菌株拜氏梭菌（C.beijerinckii）CN18进行20代连续培养实验，每代摇瓶发酵48 h，用气相色谱仪测定溶剂产量，实验结果见图2。

由图2可知，传代20次以内，菌株C.beijerinckiiCN18的发酵特性基本没有退化，丁醇、乙醇、丙酮的产量基本平稳，说明此突变菌株遗传特性非常稳定，比较适合工业化应用。

2.3 拜氏梭菌（C.beijerinckii）CN18发酵结果

对比突变株C.beijerinckiiCN18与出发菌株C.beijerinckiiNCIMB8052在不同抑制物质量浓度条件下，发酵48 h后产丁醇、乙醇、丙酮、丁酸等溶剂的能力，结果见图3。

由图3可知，无论是溶剂产量或是耐毒性，突变株都比出发菌株优异得多。在没有抑制物存在的发酵培养基中，C.beijerinckiiCN18可以利用底物发酵产出18.2 g/L总溶剂，其中包括12.8 g/L丁醇、0.6 g/L乙醇、4.8 g/L丙酮；而C.beijerinckiiNCIMB 8052只能产出13.4 g/L总溶剂，其中包括丁醇9.9 g/L，乙醇0.4 g/L，丙酮3.1 g/L。突变株的总溶剂产量提高了35.8%，丁醇产量提高了29.3%。另外，突变株的耐毒性也有显著提高，在抑制物质量浓度＞0.6 g/L之后，出发菌株的溶剂产量急剧下降，抑制物质量浓度＞0.8 g/L之后总溶剂产量≤3 g/L；而突变株在抑制物质量浓度为1.0g/L时仍然可以产出近12g/L的总溶剂，可见其耐毒性有显著提高。因此C.beijerinckiiCN18可作为进一步耐毒性研究和利用生物质原料水解液的极具潜力的菌株。

2.4 连续培养驯化选育出C.beijerinckiiCN88

利用连续培养的方法对菌种进行耐毒性驯化，最终使得突变菌株对木质素单体抑制物的耐受性有进一步的提高，结果如图4所示。

由图4可知，在连续培养过程中，初始抑制物质量浓度为0.6 g/L，5 d为一个周期，第6天抑制物质量浓度提高至0.8 g/L，第11天抑制物质量浓度提高至1.0 g/L，第16天抑制物质量浓度提高至1.2 g/L。每次菌体进入到更高一级抑制物浓度时，OD600nm值都会开始下降，同时pH值升高，随着时间的推移，OD600nm值会慢慢回升，pH值会下降，直至一个平衡的状态。这是由于菌体生长代谢分为两个阶段：产酸期及产溶剂期。在刚刚接入菌体时，由于抑制物质量浓度过高，不利于菌体生长，所以细胞浓度有所下降。经过一段时间，菌体适应了新环境，开始大量增殖，代谢进入了产酸期，因此pH值会下降，同时细胞浓度开始慢慢回升，直至一个稳定平衡的阶段。之后在进入新抑制物质量浓度环境时，此过程又重复一次，已经适应了上一质量浓度的细胞生长再次收到抑制，然后在适应新环境，细胞浓度回升至平稳，pH值先下降后上升。直至达到1.2 g/L抑制物质量浓度时，细胞浓度下降后再也没能回升，菌液浑浊度不再增加，pH值持续升高，即判断该浓度为此次驯化的终点浓度，1.2 g/L的抑制物质量浓度是C.beijerinckiiCN18耐受的最大限度。将驯化后的菌种保存好，重新命名为拜氏梭菌（C.beijerinckii）CN88。

2.5 C.beijerinckiiCN88在有抑制物存在的培养基中发酵

由图5可知，各培养基中抑制物质量浓度分别为0.6g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L时，C.beijerinckiiCN88可以分别通过厌氧发酵产出总溶剂15.2 g/L、14.4 g/L、12.7 g/L、5.2 g/L。可见，经过诱变和驯化C.beijerinckiiCN88的抑制物耐受程度有了显著提高，并且同时保证溶剂的产量不会大幅降低。该菌株可以耐受1.0 g/L的木质素降解产物。实际应用木质纤维素水解液发酵时，抑制物种类更多，但C.beijerinckiiCN88已对其中抑制效果最明显的几种有了耐受性，可以进一步尝试该菌株以木质纤维素水解液为底物进行直接发酵。

3 结论

通过对出发菌株C.beijerinckiiNCIMB 8052进行离子束诱变处理，筛选得到了突变株C.beijerinckiiCN18，该菌株相对于出发菌株丁醇产量从9.9 g/L增加至12.8 g/L，提高了29.3%；总溶剂从13.4g/L增加至18.2g/L，提高了35.8%。经过20次连续传代实验，该突变菌株具有良好的遗传稳定性。经过连续培养驯化，得到的C.beijerinckiiCN88可以耐受1.0 g/L的木质素降解产物，在抑制物质量浓度为1.0 g/L时，驯化后的菌株可产出12.7 g/L总溶剂，比出发菌株产出的1.9 g/L总溶剂提高了5.7倍；比C.beijerinckiiCN18产出的11.6 g/L总溶剂提高了9.5%。这为今后直接利用生物质水解液发酵产丁醇奠定了基础。

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Screening of inhibitor-tolerant and butanol producing strain by ion beam implantation and continuous culturing domestication

JIN Chaonan1,2,LIU Li2,SHI Jiping2,SUN Qingyuan1*
(1.School of Bioengineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 2.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China)

The mutation method of ion beam implantation was employed toClostridium beijerinckiiNCIMB 8052 in this study.As a result,a mutant strainC.beijerinckiiCN18 was screened.Comparing to the original strain,the buranol production increased from 9.9 g/L to 12.8 g/L,which improved 29.3%.Meanwhile,the total solvent production was 18.2 g/L,which was 35.8%higher than the original data of 13.4 g/L.Additionally,C.beijerinckiiCN18 could maintain stable solvent production during 20 times serial passages,which showed excellent genetic stability.In the following,a mutant strainC.beijerinckiiCN88 with high resistance of lignin-degraded products was obtained after continuous culturing domestication,which could grow well even under 1.0 g/L inhibitor.Under the inhibitor concentrations of 0.6 g/L,0.8 g/L and 1.0 g/L,it could produce 15.2 g/L,14.4 g/L and 12.7 g/L total solvents,respectively.

Clostridium beijerinckii;ion beam implantation;continuous culturing domestication;inhibitor;genetic stability

Q939.99

A

0254-5071（2015）06-0025-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.006

2015-05-17

国家自然科学基金青年科学基金（21306219）；中国科学院青年创新促进会专项经费（2015232）；中国科学院上海高等研究院交叉学科青年创新基金（141002）

金超楠（1989-），男，硕士研究生，研究方向为微生物发酵。

*通讯作者：孙庆元（1957-），男，教授，博士，研究方向为微生物降解农药残留以及食（医）用真菌的开发。