不同产地海螵蛸中核苷类成分测定

顾青青， 安 叡， 张艺竹， 于 静， 刘自华， 王新宏

（上海中医药大学，上海201203）

不同产地海螵蛸中核苷类成分测定

顾青青， 安 叡*， 张艺竹， 于 静， 刘自华， 王新宏

（上海中医药大学，上海201203）

目的比较研究不同产地海螵蛸的指纹图谱，并测定其中核苷类成分的含有量。方法海螵蛸NaCl水溶液采用高效液相色谱法，色谱柱为资生堂PAK-C18（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相为0.01 mol/L磷酸二氢钾水溶液，等度洗脱，检测波长254 nm，柱温25℃。用相似度评价系统软件计算得到各批药材的相似度。结果海螵蛸中的尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤分离度良好，线性范围分别为1.25～12.50μg/mL、1.28～12.80μg/mL和5.05～50.50 μg/mL。25批样品 （来自浙江、辽宁、云南、山东、广西、福建）相似度均大于0.9；广东的样品相似度在0.97～0.78，差异较大；海南的样品相似度均为0.88左右。结论本研究建立的HPLC指纹图谱方法可有效地区分海螵蛸及其他贝壳类海洋药材。

海螵蛸；HPLC；尿嘧啶；次黄嘌呤；黄嘌呤

海螵蛸为常用中药，具有收敛止血、涩精止带、制酸止痛、收湿敛疮等作用。《中国药典》收载的海螵蛸为乌贼科动物无针乌贼Sepiella maindroni de Rochebrune或金乌贼Sepia esculenta Hoyle的干燥内壳［1］，近年来在中医临床及中成药生产上得到越来越广泛地应用。现代研究发现，其主要成分为碳酸钙、壳角质和黏液质等，可治疗骨骼损伤［2］、 消化道溃疡［3］、 妇科疾病［4］、 出血性疾病［5］、 肝纤维化［6］和眼部疾病［7］等。

核苷类化合物作为维持生命活动的基本组成元素，主要参与DNA代谢过程，具有抗癌、抗病毒等药理活性［8］，在多种动物药里大量存在。其中，腺苷、虫草素等已成为冬虫夏草的指标成分［9-10］。近年来，在海洋动物药，如海绵［11］、柄海鞘［12］和海葵［13］中也发现了该类化合物。另外，作为海洋药用生物，海螵蛸还具有部分游离核苷类成分，如尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤等。本实验采用HPLC法建立海螵蛸药材的指纹图谱，对所收集的30个海螵蛸样品中尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤同时进行定量测定，发现该指纹图谱稳定，重复性好，可用于该药材的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1260型液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、检测器、工作站 （美国安捷伦公司）；AL104电子天平 （110～0.00001 g，瑞士梅特勒公司）；DL-120D智能超声波清洗器 （上海之信仪器有限公司）。

1.2 对照品与试剂 尿嘧啶 （上海源叶生物科技有限公司，批号TM0313XB13）；次黄嘌呤、黄嘌呤对照品 （中国药品生物制品检定所，批号分别为140661-200903、140662-200802）；氯化钠、磷酸二氢钾 （国药集团化学试剂有限公司，批号分别为10019318、10017608）；甲醇为色谱纯 （美国Thermo Fisher公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.3 实验药材 海螵蛸药材30批，分别购自上海、浙江、江苏、北京、安徽、河北等地，经上海中医药大学吴立宏研究员鉴定，均符合 《中国药典》2010年版海螵蛸项下规定，见表1。

表1 海螵蛸样品收集信息Tab.1 Origin for 30 batches of cuttlebone samples

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 取海螵蛸药材5.0 g粉碎，精密称定，置于200 mL锥形瓶中，精密加入0.9%NaCl水溶液100 mL，密塞，室温静置12 h，离心15 min（3 000 r/min），放至室温，用0.9% NaCl水溶液补足失质量，并将其浓缩至10 mL，摇匀，取续滤液，用微孔滤膜 （0.45μm）滤过，即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 对照品母液的配置 精密称取对照品尿嘧啶1.25 mg、次黄嘌呤1.28 mg、黄嘌呤1.01 mg，分别置于10mL量瓶中，甲醇溶解，超声后再用甲醇定容至刻度，即得对照品溶液。

2.2.2 混合对照品溶液的配置 精密移取尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤对照品母液 （分别为1、1、5mL）于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配置成混合对照品贮备液。其中含有尿嘧啶12.50 μg/mL、次黄嘌呤12.80μg/ML、黄嘌呤50.50 μg/mL。

2.3 色谱条件 资生堂PAK-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为0.01 mol/L磷酸二氢钾水溶液；检测波长254 nm；体积流量0.65 mL/min；柱温25℃；进样量20μL，记录45 min色谱。在此条件下，对照品及样品的色谱图见图1。理论塔板数按尿嘧啶峰、次黄嘌呤峰、黄嘌呤计算均不低于8 000。

图1 对照品（A）与样品（B）HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances（A）and saMp le（B）

2.4 海螵蛸中尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤的测定

2.4.1 线性关系考察 精密吸取 “2.2.2”项下混合对照品溶液2、4、6、8、10、16、20μL进样，按 “2.3”项色谱条件测定峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，相应质量浓度 （X，μg/mL）为横坐标，进行线性回归分析，得尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤回归方程分别为Y=121.8X-9.291（r= 0.999 5）、Y=126X+4.981（r=0.999 5）和Y= 3.704X-1.148（r=0.999 8），线性范围分别为1.25～12.50μg/mL、1.28～12.80μg/mL和5.01～50.10μg/ML。

2.4.2 精密度试验 精密吸取 “2.2.2”项下混合对照品溶液，在 “2.3”项色谱条件下连续进样6次，测定峰面积。结果尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤的RSD（n=6）分别为0.5%、0.3%和0.4%，表明仪器精密度好。

2.4.3 重复性试验 精密称取15号海螵蛸药材，按 “2.1”项下方法制备供试品溶液平行6份，连续进样，测定峰面积。结果尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤含有量的平均值分别为1.07、1.43和19.73 mg/g，RSD分别为1.8%、1.4%和1.2%，表明重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 精密称取15号海螵蛸药材，按 “2.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、6、15、24、36 h进样，测定峰面积。结果尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤峰面积的RSD（n=6）分别为1.2%、0.8%和1.0%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取已测定含有量的15号样品 （尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤含有量分别为1.07%、1.43%和19.73%）粉末2.5 g，共6份，按各组分在样品中的量，分别加入一定量混合对照品，按 “2.1”项下方法制备供试品溶液，在 “2.3”项色谱条件下进样分析，计算平均回收率。结果尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤的平均回收率（n=6）分别为101.9%（RSD=2.2%）、102.3%（RSD=1.9%）和102.3%（RSD=1.8%）。

2.5 样品测定 取30批不同产地的海螵蛸样品，按 “2.1”项下方法制备供试品溶液，在 “2.3”项条件进样分析，以外标两点法计算，结果见表2。

表2 不同产地海螵蛸中尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤测定结果（mg/g，n=3）Tab.2 DeterMination of uracil，hypoxanthine，and xanthine in cuttlebone froMdifferent regions（mg/g，n=3）

3 海螵蛸指纹图谱的建立

3.1 精密度试验 取同一份海螵蛸药材的供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图并积分，图谱导入 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版”处理，得到各次进样的相似度。结果表明，6次进样所得指纹图谱的相似度高于0.99，符合指纹图谱测定要求，精密度良好。

3.2 稳定性试验 取同一份海螵蛸药材供试品溶液，按 “2.1”项制备方法处理，分别在0、2、6、15、24、36 h进样，记录色谱图并积分，计算36 h内进样所得指纹图谱的相似度。结果表明，该指纹图谱的相似度均高于0.99，符合指纹图谱测定要求，稳定性良好。

3.3 重复性试验 取同一批海螵蛸药材6份，按“2.1”项制备方法处理，分别进样，记录色谱图并积分，计算6份海螵蛸药材所得指纹图谱的相似度。结果表明，6份样品所得指纹图谱的相似度均高于0.99，符合指纹图谱测定要求，重复性良好。3.4 指纹图谱的相似度分析 分别取不同产地的30批海螵蛸样品，按 “2.1”项下方法制备海螵蛸供试品，按 “2.3”项下色谱条件进行HPLC分析，分别记录色谱图，导入 “中药色谱指纹图谱相似度评价2004 A版”评价软件对其进行数据分析处理，以中位数法建立对照指纹图谱，30批海螵蛸的指纹图谱及相似度结果分别见图2和表3。结果显示，所测的不同产地海螵蛸的相似度范围较宽。海螵蛸样品中有25批样品 （来自浙江、辽宁、云南、山东、广西、福建）相似度均大于0.9；其中产地为广东的样品相似度在0.97～0.78，差异较大；产地为海南的样品相似度均为0.88左右。

表3 30批不同产地海螵蛸样品的相似度评价Tab.3 SiMilarity evaluation of 30 batches of cuttlebone

图2 30批不同产地海螵蛸样品的HPLC指纹图谱及对照指纹图谱Fig.2 Thirty batches of cuttlebone of HPLC fingerprints froMdifferent regions and controlled fingerprint

3.5 系统聚类分析 从图2可以看出，匹配后共有8个共有峰，其中4、5、6号峰分别为尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤的色谱峰。

以尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤的峰面积为指标，运用SPSS 18.0软件对30批不同产地海螵蛸样品进行聚类分析，采用组间均联法（betweengroups linkage），以余弦为测度进行聚类，结果见图3。由图可知，海螵蛸的聚类具有一定的地域归属性，同一产地的海螵蛸亲缘关系较近。例如，产地为浙江、辽宁、云南、广西、福建的海螵蛸样品亲缘关系较近，这与相似度分析的判断基本一致，其优势在于可以更直观用于区分不同产地的海螵蛸。

4 讨论

本实验所建立的HPLC指纹图谱测定方法可以使海螵蛸药材0.9%生理盐水提取液中的大部分小分子成分得到较好的分离，并且经方法学考察，此法有较好的精密度、重复性和稳定性，能有效评价海螵蛸药材的质量。

尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤这类化合物均为偏碱性的水溶性成分，极性均较大，因此本实验初步选择以水相为流动相进行色谱分离，另外还对海螵蛸药材的提取方法 （提取试剂及时间）、流动相系统和检测波长进行了考察。结果表明，在提取试剂上，0.9%生理盐水提取液的色谱峰较多，而20%及10%甲醇提取液的色谱峰较少；在提取时间上，设定了6、8、10、12、16 h的静置时间，而且以0.9%NaCl水溶液为溶剂，制备静置了12 h的供试液的色谱图中信息量最丰富；在检测波长上，通过二极管阵列检测器在190～400 nm的紫外区进行在线检测，发现所测成分在254 nm条件下的吸收最强，所提供的信息量最丰富，各峰的比例最适合，故选择254 nm作为检测波长。

图3 不同产地海螵蛸聚类分析Fig.3 Clustering analysis of cuttlebone froMdifferent regions

由于海螵蛸药材有效成分尚不明确，所以其质量标准一直停留在定性鉴别上，而没有定量指标。本实验通过指纹图谱来测定海螵蛸中核苷类成分的含有量，可对其进行成分半定量的控制，从而为提高海螵蛸的质量标准提供了可能。

本实验对30批次不同产地海螵蛸的指纹图谱进行相似度比较，它们分别购自各地药材市场及药店。结果表明，除来自广东及海南的样品相似度较低之外，其余样品相似度均大于0.9，且与核苷类成分含有量具有一定的相关性，说明所建立的指纹图谱可较好地用于评价海螵蛸的质量。

综合分析发现，当样品中尿嘧啶与次黄嘌呤量的比例在1.30±0.17范围内时，其相似度为0.99～0.97；当样品中尿嘧啶与次黄嘌呤量的比例在0.62±0.09范围内时，其相似度为0.97～0.90。以上结果显示，所建立的指纹图谱可较好地区分不同产地的海螵蛸，可用于其质量控制。

另外，本实验建立的HPLC指纹图谱方法具有特征性，考察了牡蛎、石决明、蛤壳和珍珠母这些贝壳类海洋药物，在确定的HPLC指纹图谱条件下测定。结果显示 （如图4），该方法可有效地区分海螵蛸及其他贝壳类海洋药物。

图4 海螵蛸与其他贝类的指纹图谱Fig.4 Fingerprints of cuttlebone and other shellfish

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DeterMination of nucleotides of cuttlebone froMdifferent regions

GU Qing-qing， AN Rui*， ZHANG Yi-zhu， YU Jing， LIU Zi-hua， WANG Xin-hong
（ShanghaiUniversity of Traditional ChineseMedicine，Shanghai201203，China）

AIMTo compare the HPLC fingerprints of cuttlebone（Sepiae endoconcha）froMdifferent regions and determine the nucleotides content.METHODSHPLC analysisof NaCl solution of cuttlebonewas carried outon Shiseido PAK-C18（4.6mm×250 mm，5μm）with amobile phase of0.01mol/L potassiuMdihydrogen phosphate solution in an isocraic elutionmanner，the flow rate was 0.65 mL/min，the sample amountwas 20μL，the detection wavelength was set at 254 nMand the column temperature wasmaintained at 25℃.The similarity software was used to evaluate the fingerprint similarity among the batches.RESULTSThemethod had good linear relationship within the range 1.25-12.50μg/mL for uracil，1.28-12.80μg/mL for hypoxanthineand，and 5.05-50.50μg/mL for xanthine.The similarity of twenty-five batcheswas greater than 0.9 collected froMZhejiang，Liaoning，Yunnan，Fujian Province，and Guangxi region，the similarity of samples froMGuangdong Provincewas over a wide range of 0.97-0.78，and the similarity of samples froMHainan Province was in 0.88 range.CONCLUTIONThe established fingerprintmethod can effectively distinguish cuttlebones froMothermarine shells.

cuttlebone（Sepiaeendoconcha）；HPLC；uracil；hypoxanthine；xanthine

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1016-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.020

2014-07-21

国家 “863”计划—海洋生物来源中药材质量标准研究 （2013AA093002）

顾青青 （1989—），女，硕士，研究方向为药物分析与体内过程。Tel：（021）51322450，E-mail：gqq19890428qq@126.com

*通信作者：安 叡 （1973—），女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为中药质量标准研究。Tel：（021）51322183，E-mail：anruimw@126.com