HPLC法测定葡萄酒中白藜芦醇的含量

柴菊华，孙晓伟，崔彦志，侍朋宝，朱凤妹

（1.河北科技师范学院食品科技学院，河北秦皇岛066600；2.朗格期酒庄秦皇岛有限公司，河北秦皇岛066600）

白藜芦醇（Resveratrol），又称芪三酚，化学名称为3，4，5-三羟基-1，2-二苯乙烯，分子式为 C14H12O3，相对分子量为228.25，是葡萄酒中重要的功能性成分，具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗过敏、抗血栓、抗高血脂、消炎、扫除自由基等多种药理活性，受到国内外医学界和葡萄酒研究者的广泛关注[1-9]。根据研究报道，葡萄品种、产区、酿造工艺、贮藏条件等因素影响葡萄酒中白藜芦醇的含量[10－20]。本文通过HPLC法检测了昌黎产区不同品种、年份和工艺酿造的葡萄酒中白藜芦醇含量，为生产高白藜芦醇含量葡萄酒提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

共29种葡萄酒，其中玫瑰香干白酒由河北科技师范学院酿酒工艺实验室提供，其余28种酒样均由朗格斯酒庄提供。

1.1.1 干红葡萄酒

2008年年份酒：4种，分别是赤霞珠传统罐贮和桶贮干红酒、赤霞珠闪蒸罐贮和桶贮干红酒；2009年年份酒：12种，包括赤霞珠传统瓶贮和桶贮干红酒，赤霞珠闪蒸瓶贮和桶贮干红酒，品丽珠传统和闪蒸瓶贮酒样，北玫、西拉、马贝克、小味儿多、马瑟兰、美乐传统瓶贮干红酒；2010年年份酒：2种，赤霞珠传统和闪蒸瓶贮干红酒。

1.1.2 干白葡萄酒

2010年年份酒：11种，即赛美蓉、白诗南、维奥尼、胡桑、增芳德、小芒森、霞多丽、雷司令、长相思、阿拉耐尔、玫瑰香瓶贮干白酒。

1.2 仪器

LC1200高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；紫外分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；KQ5200DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；AP-01P真空泵：天津市津南开发区南洋工业园；DHG-9245A型电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；Synergy超纯水机：法国Millipore公司；FA 2004 B电子天平：上海精密科学仪器有限公司；旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司。

1.3 试剂

分析纯乙酸乙酯；色谱纯冰醋酸和甲醇；娃哈哈纯净水；反式白藜芦醇标样，纯度为98%。

1.4 方法

1.4.1 标准曲线的绘制

1）反式白藜芦醇标准曲线：准确称取反式白藜芦醇标准品2 mg，用色谱甲醇定容至10 mL，再分别配制成一定质量浓度的系列标准溶液，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤上机测定。

2）顺式白藜芦醇的标准曲线：准确称取反式白藜芦醇标准品4 mg，用色谱甲醇定容至10 mL，再分别配制成一定质量浓度的系列标准溶液，经紫外线照射30 min，低温静置5 d，摇匀，经 0.45 μm 滤膜过滤后上机测定。

1.4.2 色谱条件

结合参考文献与实验室现有工作基础，稍加改进，确定色谱条件：色谱柱为反相色谱柱Eclipse XDB C-18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为甲醇：1%乙酸水=35∶65（体积比）；流速为 1.0 mL/min；反式白藜芦醇检测波长为320 nm，顺式白藜芦醇检测波长为305 nm；柱温为30℃；进样量为5 μL；DAD检测器。

1.4.3 重复性试验

采用标准品和酒样溶液，重复进样5次，得出峰时间和峰面积，计算RSD值。

1.4.4 酒样中白藜芦醇的提取

取50 mL葡萄酒，加50 mL乙酸乙酯，摇动萃取15 min，静置分层后分液，将有机相40℃旋转蒸发至干，残留物用甲醇溶解定容至10 mL。上机测定前经0.45 μm滤膜过滤。操作过程中注意避光。

2 结果和分析

2.1 检测波长的选择

通过DAD检测器在200 nm～400 nm范围内对顺反式白藜芦醇标样溶液进行光谱扫描，得到其光谱图见图1，图1显示出两种同分异构体的光谱图差异不大。用紫外分光光度计对2种标样溶液在波长190 nm～400 nm区间内扫描，紫外吸收光谱图显示，2种标样的最大吸收波长各不相同，反式白藜芦醇的最大吸收波长是320 nm，顺式白藜芦醇的最大吸收波长是305nm。因此，分别选取320 nm和305 nm作为检测反式和顺式白藜芦醇的检测波长。

图1 反式（A）和顺式（B）白藜芦醇的DAD光谱图Fig.1 The DAD spectrum of trans-and cis-Resveratrol standards

2.2 标样和酒样色谱分离效果

反式白藜芦醇在320 nm下的保留时间和顺式白藜芦醇在305 nm下的保留时间非常接近，均在10 min左右，所以不宜采用切换波长的方法进行同时测定，应设定两个波长分别进行色谱分析。标样和酒样在选定色谱条件下峰形对称，响应值大，无杂质干扰和基线漂移现象，色谱分离效果很好，见图2。

2.3 白藜芦醇标准曲线

以浓度为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，计算得到2条标准曲线：反式白藜芦醇的浓度在0.5 mg/L～10mg/L之间，线性方程为Y=18. 9227829×X+0. 9602643，相关系数r=0. 99926；顺式白藜芦醇浓度在5 mg/L～200 mg/L之间，线性方程为Y=16. 2068315×X-5. 0812315，r=0. 99992。白藜芦醇在研究范围内线性关系良好，能够满足定量分析的要求。

表1 标样和酒样重复性实验结果（n=5）Table 1 Results of repeated experiment of standard and a wine sample（n=5）

图2 标样和酒样白藜芦醇色谱图Fig.2 Chromatoragrams of standard and a wine sample

2.4 重复性实验

取2 mg/L反式白藜芦醇标样、20 mg/L顺式白藜芦醇标样和2009年闪蒸赤霞珠瓶贮酒样，连续测定5次，标样和酒样保留时间和峰面积相对标准偏差结果见表1。从表1可以看出顺反式白藜芦醇保留时间和峰面积重复性较好，保留时间的标准偏差在0.10%～0.12%，峰面积的标准偏差在0.95%～2.79%。

2.5 单品种干红葡萄酒白藜芦醇含量比较

2009年年份8种单品种干红葡萄酒（瓶贮18个月）的白藜芦醇含量存在显著差异见表2：马瑟兰干红酒反式白藜芦醇含量最高，为6.22 mg/L，其次为美乐干红酒，含量为0.93 mg/L，赤霞珠、品丽珠、小味儿多、北玫干红酒中反式白藜芦醇含量很少，西拉和马贝克干红酒未检测出反式白藜芦醇；美乐干红酒顺式白藜芦醇含量最高，为34.52 mg/L，其次为西拉和马瑟兰干红酒，含量分别为5.87 mg/L和5.57 mg/L，后面依次为马贝克＞北玫、赤霞珠＞品丽珠、小味儿多；从白藜芦醇总量看，美乐干红酒高居首位，含量为35.45 mg/L，具有很高的医疗保健作用，其次是马瑟兰干红酒，含量为11.79mg/L，后面依次为酉拉＞马贝克＞北玫、赤霞珠＞品丽珠、小味儿多；干红酒中反式白藜芦醇含量明显低于顺式白藜芦醇含量，仅占白藜芦醇总量的12.19%，顺式白藜芦醇占总量的87.81%。

表2 8种单品种干红葡萄酒白藜芦醇含量Table 2 Concentration of trans-and cis-Resveratrol in eight dry red wines mg/L

2.6 单品种干白葡萄酒白藜芦醇含量比较

陈酿6个月的11种单品种干白葡萄酒的白藜芦醇含量有显著差异见表3：增芳德顺式、反式和总白藜芦醇含量最高，分别为0.22、0.61、0.83 mg/L，其次为霞多丽干白酒，后面按白藜芦醇总量排序依次为：胡桑＞玫瑰香＞阿拉耐尔＞雷司令＞小芒森＞长相思＞白诗南＞赛美蓉，维奥尼干白酒未检测到白藜芦醇。干白葡萄酒反式与顺式白藜芦醇平均含量分别占平均总量的57.69%和42.31%，但均远远低于干红葡萄酒，分别为干红葡萄酒的15.31%和1.56%，白藜芦醇总量仅为干红葡萄酒的3.23%。

表3 11种单品种干白葡萄酒白藜芦醇含量Table 3 Concentration of trans-and cis-Resveratrol in eleven dry white wines mg/L

2.7 闪蒸与传统干红葡萄酒白藜芦醇含量比较

闪蒸工艺显著提高干红葡萄酒白藜芦醇含量见表4：2008年～2010年闪蒸赤霞珠干红酒分别比传统赤霞珠干红酒白藜芦醇总量提高了35.61%、318.31%和57.48%；2009年闪蒸品丽珠干红酒分别比传统品丽珠干红酒白藜芦醇总量提高了436.60%；闪蒸干红酒白藜芦醇总量比传统干红酒平均提高了118.45%。闪蒸处理提高白藜芦醇含量的效果与年份、葡萄品种、制作工艺、贮藏方式等因素有关。

表4 闪蒸和传统红葡萄酒白藜芦醇含量Table 4 Concentration of trans-and cis-Resveratrol in dry red wines made by flash realease technology and traditional technology mg/L

3 结论

1）29种葡萄酒平均反式白藜芦醇含量为0.66 mg/L，占总量的7.99%，顺式白藜芦醇含量为4.53mg/L，占92.01%。

2）8种单品种干红酒的白藜芦醇含量存在明显差异，平均白藜芦醇含量为8.04 mg/L，总量范围在1.29 mg/L～34.52 mg/L，其中美乐干红酒含量最高，其次是马瑟兰和西拉干红酒。

3）11种单品种干白酒的白藜芦醇含量存在明显差异，平均白藜芦醇含量为0.26 mg/L，总量范围在0 mg/L～0.83 mg/L，其中增芳德干白酒含量最高。

4）干红酒白藜芦醇含量远远高于干白葡萄酒，平均含量是其30.92倍。

5）6种闪蒸干红酒白藜芦醇平均含量为9.59 mg/L，而对照（6种传统干红酒）平均含量仅为4.39 mg/L，闪蒸工艺提高白藜芦醇含量118.45%。

4 讨论

反式白藜芦醇标准溶液经紫外光直接照射30min，之后检测其中的反式白藜芦醇含量，发现反式标样尚未转化。静置3 d～5 d后，意外发现320 nm检测条件下检测不到反式标样，而305 nm检测条件下出现了较大吸收峰，说明反式白藜芦醇已完全转化成顺式白藜芦醇，但其相应浓度的峰面积有所减小。另外，白藜芦醇标样和酒样提取液应尽快上机测定，否则可能由于长时间存放导致白藜芦醇的转化影响测定结果的准确性。今后应进一步试验反式白藜芦醇标样完全转化成顺式白藜芦醇标样的优化条件、顺反式白藜芦醇糖苷的快速检测方法。

昌黎是我国第一个受到原产地保护的沿海地域，紫外线辐射强，葡萄生长季节气候凉爽湿润，对白藜芦醇形成有利[9，11，13，16]。昌黎产区可选择高产白藜芦醇的优良品种美乐、马瑟兰、西拉等品种，在气候条件允许的前提下尽量提高原料成熟度，结合闪蒸工艺等措施，开展高白藜芦醇含量葡萄酒生产关键技术的集成研究，开发保健优质特色干红葡萄酒。

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