响应面优化柚皮苷酶对长坝柚汁的脱苦工艺

肖仔君，文淑仪，唐辉，钟瑞敏

（韶关学院英东食品科学与工程学院，广东韶关512005）

柚皮苷是柚汁中的苦味物质，是一种黄烷酮糖苷类化合物，由柚皮素-7-p-D-葡萄糖-α-L-鼠李糖构成，分子式为C27H32O14·2H2O，相对分子质量为616.58。柚皮苷易溶于热乙醇中，在热水和热乙酸中可溶，冷水和冷乙醇中微溶，乙醚、氯仿、苯中不溶[1]。随着我国经济和人们生活水平的提高，对柑橘汁的需求量也呈现快速增长。然而柑橘类水果在其果汁加工过程中，由于经过榨汁、热加工等工艺处理，苦味物质被释放出来，使得柑橘汁的口感大大下降。另一方面，这些苦味物质是保持产品特有风味必不可少的，但苦味过强就会影响产品的口感、质量和销售。所以柑橘类果汁的脱苦是柑橘类水果深加工的关键技术。

目前柑橘类果汁中苦味物质的脱除方法主要有以下几种，如：屏蔽脱苦法，陈艺晖[2]等以0.6%β-环糊精脱除柚皮苷的效率为87.21%。此外，还有固定化细胞脱苦、超临界脱苦、膜分离脱苦、酶法脱苦、吸附脱苦、基因工程脱苦等方法[3-8]。其中酶法脱苦具有操作简单、作用条件温和、脱苦效率高、专一性强、便于应用等优点，是目前最具有发展的脱苦方法之一[6]。

柚皮苷酶由α-L-鼠李糖苷酶（EC3.2.1.40）和β-D-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）组成的一个酶系，是一种胞外酶。柚皮苷首先被α-L-鼠李糖苷酶水解成略有涩味但无苦味的樱桃苷（Prunin）和鼠李糖（Rhamnose），樱桃苷（Prunin）的苦味是柚皮苷的1/3，苦味有所减轻。然后在樱桃苷（Prunin）在β-D-葡萄糖苷酶的作用下变成无苦味的柚皮素（Naringenin）和葡萄糖（Glucose）[3]。本试验主要研究了柚苷酶脱去长坝沙田柚果汁苦味物质的工艺参数，为今后长坝沙田柚汁脱苦的工艺技术提供技术参考。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料、试剂与仪器

长坝沙田柚：采摘于韶关市金柚公司的果场。柚皮苷标准品：购于广州市齐云生物技术有限公司，纯度在99.8%以上；柚苷酶，600 IU/g：广州市齐云生物技术有限公司。

二甘醇、磷酸氢二钾、无水乙醇、硝酸钾、柠檬酸、氢氧化钠均为分析纯。

772N可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；HH-S28S数显恒温水浴锅：江苏省金坛市大地自动化仪器厂；分析天平BS124S：北京赛多利斯天平有限公司；TGL-16C台式离心机：上海安亭科学仪器厂；pH计pHS-3C型：上海精密雷磁公司。

1.2 柚汁制备工艺

柚子→去皮→破碎→榨汁→加入果胶酶→搅匀→抽滤→离心（ 4000 r/min、10 min）→原果汁

1.3 方法

1.3.1 单因素实验

按照实验方法，分别以反应时间、反应温度、酶用量以及pH为影响因素，设置4个因素来确定相关因素对柚苷酶脱苦效率的影响。

1.3.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，选取反应时间（A）、反应温度（B）和酶用量（C）为实验因素，以柚皮苷的脱苦率为实验指标，设计了三因素三水平的响应面分析实验[10-11]，其水平编码表见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and the levels of experiment of response surface analysis

1.4 分析方法

1.4.1 柚皮苷标准曲线的测定

将柚皮苷标准品在110℃下干燥至恒重，称取20.0 mg，添加0.1 mol/L的NaOH 20 mL使其完全溶解后，用柠檬酸调至pH至6，定容至100 mL，得柚皮苷标准液，稀释2.5倍得0.08 mg/mL的标准液溶液，同时再作一空白液作标准稀释用。分别吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的0.08 mg/mL的标准品稀释溶液，于6 支试管中，分别添加空白液 5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 和0.0 mL，再各加90%二甘醇5.0 mL和4 mol/L NaOH 0.1 mL，置于40℃恒温水浴保温条件下进行显色反应10 min，然后立即注入1 cm比色皿内，在420 nm的波长处测吸光度。以吸光度对标样柚皮苷含量作图，绘制标准曲线见图 1[3，9，12]。

图1 标准曲线图Fig.1 Standard curve

1.4.2 样液的测定

取2 mL果汁和pH 3.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.9 mL置于试管中，在40℃恒温水浴中预热4 min～5 min，然后加入酶液0.1 mL，充分摇匀，准确保温30 min，迅速吸取0.1 mL，置于15 mL比色管中，加入90%—缩二乙二醇5 mL，蒸馏水0.4 mL和1 mol/L NaOH溶液0.5 mL，摇匀，在30℃保温30 min。倒入比色皿中，在420 nm波长下测定吸光度[9]。

式中：C1为由待测液吸光值在标准曲线计算所得的柚皮苷含量，（mg/L）；V1为样液测定时溶液的总体积，mL；V为量取得待测液体积，mL。

1.5 感官评定[13]

挑选10名食品专业人员进行脱苦前后柚汁的感官评价，以5分记（苦味强烈记0～1分、有苦味，无柚汁浓郁香味记2分～3分、无感官苦味，明显品尝出柚汁浓郁香味记4分～5分）。

1.6 数据分析

脱苦率是表示柚皮苷酶解的程度。在柚苷酶的作用下，使柚皮苷酶解成无苦味物质，若柚皮苷被酶解的越多，那么果汁中的柚皮苷所剩余的量就越少，苦味越低，吸光值也越来越小，脱苦率则越高。

式中：C为酶解前果汁中柚皮苷的含量，（mg/L）；C1为酶解后果汁中柚皮苷的含量，（mg/L）。

2 结果与讨论

2.1 酶解时间对脱苦效果的影响

首先研究酶解时间对柚汁脱苦效率的影响，在柚汁的自然pH下，酶解温度为40℃，酶用量为0.5 g/L的条件下进行柚汁脱苦研究结果见图2。

图2 酶解时间对脱苦效果的影响Fig.2 The effect of reaction time on debittering

从图2可知，脱苦率先是随着时间的延长脱苦效率增大，在150 min时达到了最大值，随后，脱苦率又开始稍许降低。这可能是因为随着酶解时间延长，柚皮苷减少，产物增多，逆反应增强；也可能随着酶解时间延长，柚汁中含有的柚皮苷慢慢溶出，导致整个体系中柚皮苷增大，脱苦率表现为下降趋势[14]。综合考虑，酶解时间为150 min较为合适。

2.2 酶解温度对脱苦效果的影响

在柚汁自然pH，酶解时间为150 min，酶用量为0.5 g/L，不同的酶解温度条件下进行柚汁脱苦研究结果如图3所示。

图3 酶解温度对脱苦效果的影响Fig.3 The effect of reaction temperature on debittering

从图3中知，脱苦效果先是随着温度的升高而升高，温度达到50℃时脱苦效果最高，之后随着温度的升高，脱苦效果有所降低。其实温度对柚苷酶的酶促反应的影响有两方面：一方面是当温度升高时，与一般化学反应一样，反应速度也加快；另一方面，随温度升高而使柚苷酶逐步变性，从而降低酶的活性[15]。因此，随着反应温度升高，酶开始失活，影响了酶解反应的产率。试验结果表明50℃的酶解温度是较适宜的。

2.3 酶用量对脱苦效果的影响

在柚汁自然pH，酶解时间为150 min，酶解温度为50℃，添加不同剂量的酶液的条件下进行柚汁脱苦研究结果见图4。

图4 酶用量对脱苦效果的影响Fig.4 The effect of naringinase usage on debittering

酶用量对脱苦研究有较大的影响，若酶用量不足，那么反应底物充足，柚皮苷水解不能完全，脱苦率不高，若酶用量过多，底物浓度相对降低，则反应物与酶接触不充分，并且酶与酶之间也会产生竞争性抑制，使脱苦率下降。从图4中可以看出，在酶用量小于0.5 g/L时，脱苦率随酶用量的增加而增大；酶用量增加到0.5 g/L时，脱苦率最大，接着在酶用量0.6、0.7、0.8 g/L时逐渐下降，酶用量大于0.8 g/L时脱苦率稍微呈向上的趋势，基本变化不大。综合考虑，酶用量为0.5 g/L时脱苦效率较好。

2.4 果汁的pH对脱苦效果的影响

在柚汁酶解时间为150 min，酶用量为0.5 g/L，酶解温度为50℃，不同柚汁pH的条件下进行柚汁脱苦研究结果见图5。

图5 果汁的pH对酶法脱苦的影响Fig.5 The effect of pH of juice on debittering

每种酶都有最适pH，在最适pH下翠花反应的速率最快。过高或过低的pH都会影响酶蛋白的构象，影响底物和酶活性中心部位基团的解离，从而影响酶反应的速度，甚至使酶变性而失活。从图5中可以看出当pH为4.0之前，脱苦率都随着pH的升高而提高，pH大于4.0后，柚汁脱苦率就逐步下降。所以实验选择适宜的pH为4.0。

2.5 响应面优化

根据单因素实验中，各因素对脱苦率的影响程度，结合实际试验操作，选取其中3个对脱苦率影响较大的的因素来作为响应面的因素，即：时间、温度、酶用量。

采用Design-expert 7.1.6软件进行响应面试验设计，共产生了17个实验，其中12个实验为析因实验，5个为中心试验以估计误差。分析方案及结果如下表2所示。

表2 响应面设计方案及实验结果Table 2 Observed and estimated values for different levels of experimental design

回归方程的建立及方差分析如下。

采用Design-expert 7.1.6软件对表3中数据进行回归分析，建立响应面回归模型：Y=51.44-0.087A+1.163B+0.275C-1.050AB-0.775AC+0.375BC-2.220A2-2.920B2-0.095C2。

因素的ANOVA分析结果见表3。

由表3可知，模型的“Prob＞F”值小于 0.01，表明二次方程拟合显著，失拟项F值大于0.05，表明失拟项相对于绝对误差是不显著的。即各因素值和响应面之间的关系可以用此模型来函数化。从表3中的P值得知，B、AB 对柚皮苷的脱苦率为显著（P＜0.05），A2、B2对柚皮苷的脱苦率为高度显著（P＜0.01）。由此可以见，各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。而且，本实验的回归方程也是显著的，相关系数R2=0. 9199，说明响应面（脱苦率）的变化有91.99%来源于所选变量，即反应时间、反应温度和酶用量。因此，回归方程可以较好的描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用回归方程确定最佳提取工艺条件。

表3 回归方程分析Table 3 Analyze of mean square

2.5.1 响应面交互及优化

根据表3的回归模型方差分析结果，作出相应的响应面，如图6～图8，比较三图可知，酶解温度是影响柚汁脱苦的主要因素，酶解时间与酶解温度交互影响为显著，表现为曲线较陡。酶用量和酶解温度与酶解时间的交互都不显著，由等高线图可看出，拟合面柚皮苷脱苦率最高值存在，说明各因素都有一个对应的最适值存在。

图6 酶解温度与酶解时间的交互影响Fig.6 Response surface of interrelated influence of hydrolysis temperature and hydrolysis time to debittering rate

图7 酶用量与酶解时间的交互影响Fig.7 Response surface of interrelated influence of the amount of enzyme and hydrolysis time to debittering rate

图8 酶用量与酶解温度的交互影响Fig.8 Response surface of interrelated influence of the amount of enzyme and hydrolysis temperature to debittering rate

通过回归模型预测的柚皮苷酶解工艺最佳条件为：酶解温度为53.1℃，酶解时间为141.9 min量为0.5 mL。在此条件下，脱苦率理论上可以达到52.0%，考虑到实际操作的可行性，将回归方程得到的理论值修正为：酶解温度为53℃，酶解时间为142 min，酶用量为0.5 g/L。

2.5.2 验证实验结果

为了验证优化结果的可靠性，按照上述结论（酶解温度为53℃，酶解时间为142 min，酶用量为0.5 g/L在此酶解条件下重复3次实验，测定其脱苦率，并进行感官评定其平均脱苦率为51.5%，与理论值相差甚微。说明采用响应面得到的柚皮苷酶对柚子汁脱苦的工艺参数是准确可靠的，具有一定的实际价值。另外，通过感官评定，脱苦前与脱苦后感官有明显的差异，脱苦前，感官评价在0.6分，有强烈的苦味，脱苦后，感官分值较高，达4.0分（以5分记），无明显的苦味，并能品尝出柚汁浓郁的香味。由此可说明用柚皮苷酶对对长坝柚汁进行脱苦具有实际应用前景。

3 结论

以长坝柚子为原料，选择柚皮苷酶对长坝柚子的脱苦率为指标，在单因素实验的基础上，采用响应曲面法对柚皮苷酶的脱苦工艺进行研究，确定最佳脱苦工艺为：柚苷酶的添加量为0.5 g/L，酶解温度为53℃，酶解时间为142 min，柚汁的pH为4，在此条件下脱苦率达到51.5%。

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