米糠多糖的免疫增强作用

刘梁，孙维矿，赵玲，李赫宇，陈新，*

（1.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023；2.天津市益倍建生物技术有限公司，天津300457）

米糠是一种具有很大潜力的优质食品原料，国内外都非常重视米糠的开发利用[1]。米糠多糖有着很好的生理功能，较强的抗肿瘤和降血清胆固醇功能，对提高免疫力和降低血糖水平等也有一定功效，可用于药品、保健营养品及化妆品的原料或添加剂，有着较广阔的应用领域[2-8]。近20年来，对多糖免疫活性的研究是免疫药理学领域的研究热点之一[9-10]。前期工作中，我们通过提取、膜分离、醇沉、酶解、冷冻干燥等手段从米糠中提取分离得到不同纯度和分子量的米糠多糖 SPK-1、SPK-2、SPK-3、SPK-4。本文主要通过研究以上4种米糠多糖样品对体外小鼠脾脏淋巴细胞活性的影响，以及样品对细胞因子IFN-γ，IL-2，IL-10，IL-12，IL-17分泌的影响，考察米糠多糖的免疫增强作用，为进一步揭示 SPK-1、SPK-2、SPK-3、SPK-4 免疫增强作用的机理提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

由本实验室从米糠中分离得到的米糠多糖SPK-1、SPK-2、SPK-3、SPK-4。CCK-8 试剂盒：日本同仁化学；二甲基亚砜（DMSO，分析纯）、胎牛血清：FBS，上海玉博生物科技公司；RPMI-1640培养液：青岛海博生物技术有限公司；细菌脂多糖：LPS，Sigma公司；刀豆蛋白-A：ConA，Sigma公司。

1.2 仪器和设备

SpectraMax M2e酶标仪：美国Molecular Devices公司；细胞计数板：上海市求精生化试剂仪器有限公司；24、96孔细胞培养板：美国Corning公司；XS204型Mettler Toledo分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；HH-2型数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；CO2培养箱：美国Revco公司；HITACHI-CR22G高速冷冻离心机：日本日立电器公司；UV-5800PC型紫外-可见分光光度计：上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠多糖样品溶液的配制及小鼠脾脏淋巴细胞的制备

分别称取25 mg米糠多糖 SPK-1、SPK-2、SPK-3、SPK-4，用含10%FBS的RPMI-1640培养液溶解并定容到100 mL，过滤除菌后，用含10%FBS的RPMI-1640培养液稀释至所需浓度，备用。

将C57BL/6小鼠用颈椎脱臼的方法处死，75%酒精浸泡消毒，在无菌条件下取其脾脏，剔除结缔组织，先用生理盐水清洗3次，然后放入含10%FBS的RPMI-1640培养液的培养皿中，用剪刀将脾脏剪成碎片后，用毛玻片轻柔研磨，过200目不锈钢细胞筛，用含10%FBS的RPMI-1640培养液冲洗网筛，收集滤过的细胞悬液，离心（ 2000 r/min）10 min，弃上清液，用适量含10%FBS的RPMI-1640培养液重悬细胞，台盼蓝染色计数，用含10%FBS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至所需浓度（细胞活率95%以上），备用。

1.3.2 活性测定

1.3.2.1 CCK-8法检测细胞活力

CCK-8法是用于测定细胞增殖或细胞毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。CCK-8被细胞内脱氧酶生物还原后生成的橙色甲瓒染料能够溶解于组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。不同浓度的多糖样品与小鼠脾脏淋巴细胞体外共培养48 h，考察样品对淋巴细胞活力的影响作用，观察样品是否有细胞毒性或促进细胞的活化及增殖活性。具体操作：小鼠脾脏淋巴细胞（8×105个/孔）接种于96孔板，同时加入不同浓度250、50、10、2、0.4、0.08、0.016 μg/mL 的样品，对照组样品浓度为0，并以含10%FBS的1640培养液补至相同体积受试样品，对照组样品浓度为0，并以含10%FBS的1640培养液补至相同体积。将培养板放在培养箱中（37℃，5%CO2）培养24或48 h。培养结束前8 h向每孔加入20μL CCK-8溶液。培养结束时，用酶标仪测定450 nm处OD值。

1.3.2.2 丝裂原ConA、LPS诱导脾脏淋巴细胞增殖实验

常规制备5×106个/mL脾脏淋巴细胞悬液，于96孔板中每孔加100 μL不同浓度受试样品，加入50 μL不同浓度受试样品，同时加入ConA（终浓度5 μg/mL或1 μg/mL）50 μL诱导T淋巴细胞活化增殖，或者LPS（终浓度 10 μg/mL 或 1 μg/mL）50 μL 诱导 B 淋巴细胞活化增殖，另设相应的阳性对照及无刺激本底对照。37℃，5%CO2培养箱中培养48 h。培养结束前8小时掺入0.25 μCi 3H-thymidine。培养结束后，将培养板冻存于-20℃冰箱，待测。用3H掺入法测定细胞增殖。

1.3.2.3 丝裂原ConA、LPS诱导脾脏淋巴细胞分泌细胞因子

24孔培养板中小鼠脾细胞5×106个/孔，同时加入受试药物及 ConA（5 μg/mL）或 LPS（10 μg/mL），另设相应刺激对照（仅加入细胞和刺激剂）和无刺激对照（只有细胞，无刺激剂），并加入相应体积含10%FBS的RPMI-1640培养液，终体积2 mL。细胞于37℃培养箱中培养48 h，收集上清液，采用ELISA法检测上清液中细胞因子浓度。

2 结果与讨论

2.1 米糠多糖对小鼠脾脏细胞体外活性的影响

不同浓度的多糖样品与小鼠脾脏淋巴细胞体外共培养48 h，对淋巴细胞活性的影响如图1中所示。

图1 米糠多糖对体外正常小鼠脾脏淋巴细胞活性的影响Fig.1 The influence of rice bran polysaccharide on the activity of spleen lymphocytes of normal mice in vitro

细胞活力=（加药组OD值-培养液本底对照组OD值）/（溶媒对照组OD值-培养液本底对照组OD值）×100%，细胞活力：＞100%显示样品没有直接的细胞毒性，细胞有活化增殖的现象；＜75%显示样品具有细胞毒性作用，影响细胞的存活；control组，溶媒对照；OD值均为酶标仪中自动减去培养液本底对照组OD值后的结果。

实验运用了CCK-8法检测了米糠多糖样品对小鼠脾脏细胞活力影响，实验结果表明，在未加丝裂原刺激条件下，米糠多糖SPK-1在浓度为250、50、10、2 μg/mL时均对小鼠淋巴细胞有显著促进增殖作用，SPK-2在浓度为250 μg/mL时对小鼠淋巴细胞有显著促进增殖作用，SPK-3在浓度为250、50 μg/mL时对小鼠淋巴细胞有显著促进增殖作用；SPK-4在浓度为250 μg/mL时对小鼠淋巴细胞有显著促进增殖作用。米糠多糖4个样品与小鼠淋巴细胞共培养均未见明显的细胞毒性。

2.2 受试米糠多糖样品在ConA/LPS分别诱导的脾脏T/B淋巴细胞活化增殖中的影响作用

受试米糠多糖样品在ConA/LPS分别诱导的脾脏T/B淋巴细胞活化增殖中的影响作用见图2。

图2 米糠多糖对ConA诱导的脾脏T淋巴细胞增殖中的影响作用Fig.2 The influence of Rice bran polysaccharide on T lymphocytes proliferationspleen induced by ConA

增强/抑制百分比=（受试样品组CPM值-刺激对照组CPM值）/（刺激对照组CPM值-细胞对照组CPM值），数值﹥0，说明样品促进细胞增殖，数值＜0，说明样品抑制细胞增殖。

在本试验中，分别检测了受试样品在ConA5μg/mL，ConA1μg/mL（低浓度，低水平诱导剂量），LPS10μg/mL，LPS 1 μg/mL（低浓度，低水平诱导剂量）丝裂原诱导的脾脏淋巴细胞活化增殖中的影响作用。试验结果显示，受试样品分别在正常剂量和低剂量的ConA/LPS诱导的小鼠脾脏淋巴细胞活化增殖反应中，分别有轻度的增强或抑制作用，但就每个样品来看没有明确的趋向性，即浓度梯度依赖性的影响作用。

图3 米糠多糖对LPS诱导的脾脏B淋巴细胞增殖中的影响Fig.3 The influence of Rice bran polysaccharide on Spleen B lymphocyte proliferationspleen induced by LPS

2.3 受试样品对ConA、LPS诱导脾脏淋巴细胞活化分泌细胞因子的影响作用

运用ELISA方法检测受试米糠多糖样品对LPS、ConA诱导脾脏淋巴细胞活化分泌IFN-γ，IL-2，IL-10，IL-12，IL-17等细胞因子的影响作用，结果见图4～7。

图4 米糠多糖对ConA诱导脾脏淋巴细胞分泌IL-2的影响Fig.4 Effects of rice bran polysaccharide on ConA induced IL-2 secretion of spleen lymphocytes

图5 米糠多糖对ConA诱导脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ的影响Fig.5 Effects of rice bran polysaccharide on ConA induced IFN-γ secretion of spleen lymphocytes

图6 米糠多糖对LPS诱导脾脏淋巴细胞分泌IL-10的影响Fig.6 Effects of rice bran polysaccharide on LPS induced IL-10 secretion of spleen lymphocytes

图7 米糠多糖对LPS诱导脾脏淋巴细胞分泌IL-17的影响Fig.7 Effects of rice bran polysaccharide on LPS induced IL-17 secretion of spleen lymphocytes

实验选取了 25、5、1 μg/mL 3 个浓度的样品，检测相应浓度下样品对ConA、LPS诱导脾脏淋巴细胞活化分泌细胞因子的影响。

白细胞介素-2（IL-2）主要是T淋巴细胞分泌的一种淋巴因子，在机体免疫方面具有重要作用，是一种免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和提高免疫力的作用，我们在实验中发现 SPK-2（25 μg/mL、1 μg/mL）、SPK-3（25 μg/mL）SPK-4（5 μg/mL）都能够显著促进IL-2的分泌。

干扰素-γ（IFN-γ）主要是由活化的T细胞和NK细胞产生，称为Ⅱ型干扰素，通常由抗原与有丝分裂原诱导产生。干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。SPK-1（25 μg/mL，5 μg/mL）、SPK-4（25 μg/mL，5 μg/mL）均能促进ConA诱导小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ；而SPK-4在1 μg/mL的米糠多糖样品却显著抑制了IFN-γ的分泌。

白细胞介素-10（IL-10）是一种多功能负性调节因子，主要是由Th2细胞、活化的B细胞、单核细胞、巨噬细胞产生，它参与免疫细胞、炎症细胞、肿瘤细胞等多种细胞的生物调节。IL-10具有很强免疫抑制及免疫调控作用，IL-10还是某些肿瘤细胞的生长因子，在本试验中，SPK-3在25 μg/mL浓度下对LPS诱导的小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-10有显著的促进作用；而SPK-4 在 5 μg/mL，1 μg/mL 浓度下对 IL-10 分泌表现出显著地抑制作用。

白细胞介素-17（IL-17）是一种前炎症细胞因子，能够促进多种细胞释放炎性因子，与多种炎症及自身免疫疾病有关。在本试验中 SPK-2（25、5、1 μg/mL）、SPK-3（5、1 μg/mL）、SPK-4（1 μg/mL）均能显著抑制ConA诱导小鼠脾脏细胞分泌IL-17的作用。

3 结论

SPK-1：我们采用CCK-8法检测米糠多糖样品体外对小鼠脾脏淋巴细胞活性作用影响，发现在250、50、10、2 μg/mL 浓度时，SPK-1 能显著促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖，且在试验浓度范围内没有表现出显著地毒性作用。我们用ELISA法检测该样品对细胞因子分泌的影响，观察到样品在25、5 μg/mL两个浓度下，能够显著促进ConA诱导的小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ。

SPK-2：采用同样的方法，我们观察到SPK-2在250 μg/mL时能够显著促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖；并且SPK-2在25、1 μg/mL浓度时能够促进ConA诱导的小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-2，且在25、5、1 μg/mL三个浓度下都能明显抑制ConA诱导的小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-17。

SPK-3：采用同样的方法，我们观察到SPK-3在250、50 μg/mL时能够显著促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖；并且SPK-3在25μg/mL浓度时能够促进ConA诱导的小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-2以及LPS诱导小鼠细胞分泌IL-10；SPK-3在5、1μg/mL浓度下能够显著抑制ConA诱导的小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-17。

SPK-4：采用同样的方法，我们观察到SPK-4在250 μg/mL浓度时能显著促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖，SPK-4在5、1 μg/mL能够显著促进IL-2的分泌；在 25、5 μg/mL时能显著促进 IFN-γ的分泌；在5、1 μg/mL时能够抑制IL-10的分泌；在1 μg/mL时可明显抑制IL-17分泌。

免疫活性测试结果表明：在CCK-8试验中，受试的这4种样品在高浓度状况下均没有表现出显著地细胞毒性，相反，却表现出显著的促进细胞增殖的作用，提示我们该系列样品可能存在免疫促进的作用；另外，在检测该系列样品对ConA或LPS诱导的小鼠脾脏淋巴细胞分泌细胞因子时，我们观察到该系列样品对IL-2、IFN-γ等细胞因子的分泌存在显著的促进作用，也显示相应的样品具有免疫增强作用。

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