参茸玉液酒中多糖含量测定方法研究

2014-12-16蔡树杏吴笛王德勤

食品研究与开发 2014年22期

蔡树杏，吴笛，王德勤

（广州白云山和记黄埔中药有限公司现代中药研究院，广东广州510515）

参茸玉液酒由人参、黄精、枸杞子、茯苓、巴戟天、川芎、益智仁、马鹿茸组方配伍而成，具有提高免疫力的功效，其主要功效成分为皂苷类成分和多糖类成分。枸杞子[1]为茄科植物宁夏枸杞Lyciun bararum L.的干燥成熟果实，具有滋补肝肾、养血补精、明目的作用。黄精[2]为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黄精 Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根茎。具有补气养阴、健脾等功效。枸杞子和黄精是参茸玉液酒中多糖成分的主要来源。现代药理学研究[3]证明了其多糖具有增强免疫、降血脂等多种生理活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

参茸玉液酒（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：20110705）；无水葡萄糖（中国药品生物制品检验所，批号：110833-200503）；苯酚（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；蒽酮（国药集团化学试剂有限公司，批号：20120803，分析纯）；浓硫酸（广州化学试剂厂，分析纯）；十万分之一电子天平（Sartorius，CP225D）；水浴锅（上海一恒科技有限公司，HWS24）；紫外分光光度计（岛津，UV-2550）。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备

精密称取无水葡萄糖对照品16.90 mg，置100 mL量瓶中，加水适量溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.2 供试品溶液的制备

精密量取供试品5 mL，置烧瓶中，减压回收溶剂至干，残渣加入80%乙醇150 mL，加热回流1 h，趁热滤过，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10 mL，将残渣和滤纸置250 mL烧瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加热回流1 h，趁热滤过，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10 mL，合并滤液和洗涤液，放冷，转移至250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。

1.2.3 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，分别置10 mL具塞刻度试管中，各精密加水至2.0 mL，精密加入4%的苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，置80℃水浴中保温30 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的溶剂为空白，于490 nm处测定吸光度，以对照品加入量为横坐标，吸光度值为纵坐标，进行线性回归分析。

1.2.4 样品分析

精密量取供试品溶液1 mL，置10 mL具塞刻度试管中，精密加水1 mL，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入4%的苯酚溶液1 mL”起，依法测定吸光度值，从标准曲线上读出供试品溶液中含葡萄糖的重量（mg），计算，即得。

2 结果与分析

2.1 苯酚浓度的选择

分别称取苯酚适量，加蒸馏水配制成2%、3%、4%、5%、6%的溶液，精密量取1 mL，再分别精密加入供试品溶液1 mL、水1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，置40℃水浴中保温30 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的溶剂为空白，在400 nm～800 nm扫描，见图1。并于最大吸收波长处测定吸光度，见表1，根据吸光度确定苯酚的最佳浓度。

图1 供试品光谱图Fig.1 Absorption spectrum of sample

表1 苯酚浓度对吸光度的影响Table 1 Impact of concentration of phenol on the absorbance

加入2%、3%、4%、5%、6%的苯酚溶液对吸收峰的影响不大，最大吸收峰为490 nm。苯酚浓度为4%时，供试品的吸光度值最大，因此，选择加入4%的苯酚溶液进行供试品溶液的制备。

2.2 硫酸溶液用量

分别精密量取供试品溶液4份，每份1 mL，各精密加水1 mL、4%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸 4、5、6、7 mL，摇匀，放置 10 min，置 40 ℃水浴中保温30 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的溶剂为空白，于490 nm处测定吸光度值，见表2，比较吸光度值，确定硫酸用量。

表2 硫酸加入量对吸光度值的影响Table 2 Impact of volume of sulfuric acid on the absorbance

供试品溶液在加入硫酸的量为5 mL时，吸光度值最大，故选择加入硫酸的量为5 mL。

2.3 水浴温度的选择

分别精密量取供试品溶液4份，每份1 mL，各精密加水1 mL、4%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸 5 mL，摇匀，放置 10 min，分别置 40、60、80、100 ℃水浴中保温30 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的溶剂为空白，于490 nm处测定吸光度值，见表3，比较吸光度值，确定水浴温度。

表3 水浴温度对吸光度值的影响Table 3 Impact of temperature of water bath on the absorbance

结果表明，水浴温度对吸光度值的影响不明显，为了保证显色反应完全，且方便操作，选择80℃为供试品的水浴温度。

2.4 水浴时间

分别精密量取供试品溶液4份，每份1 mL，各精密加水1 mL、4%苯酚溶液1mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，在80℃水浴中，分别保温 15、20、30、40 min，迅速冷却至室温，以相应的溶剂为空白，于490 nm处测定吸光度值，见表4，比较吸光度值，确定水浴时间。

表4 水浴时间对供试品吸光度的影响Table 4 Impact of time of water bath on the absorbance

结果表明，水浴时间对吸光度值的影响不明显，为了保证显色反应完全，且方便操作，选择30 min为供试品的水浴时间。

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线的测定

精密量取对照品溶液 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，分别置10 mL具塞刻度试管中，各精密加水至2.0 mL，精密加入4%的苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，置80℃水浴中保温30 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的溶剂为空白，于490 nm处测定吸光度，见表5，以对照品加入量为横坐标，吸光度值为纵坐标，进行线性回归分析，见图2，得回归方程y=1.096x-0. 0514，r2=0. 9993，线性范围为0. 02535 mg/mL～0. 05915 mg/mL。

表5 标准曲线Table 5 Standard curve

图2 标准曲线Fig.2 Standard curve

2.5.2 精密度试验

精密吸取对照品溶液0.4 mL，置10 mL具塞刻度试管中，精密加水至2.0 mL，精密加入4%的苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，置80℃水浴中保温30 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的溶剂为空白，于490 nm处连续测定吸光度值6次，见表6，计算RSD值为0.38%，说明仪器精密度良好。

表6 精密度试验Talbe 6 Precision test

2.5.3 稳定性试验

对同一份显色后的供试品，在490 nm处，分别放置 0、10、20、30、60、120、180 分钟后测定吸光度值，见表7，计算RSD为1.13%，说明样品放置3 h稳定性良好。

表7 稳定性试验Talbe 7 Stability test

2.5.4 重复性试验

分别取同一批样品6份，按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，分别取供试品溶液1 mL，加水1 mL，再加入4%的苯酚溶液1 mL及硫酸5 mL，摇匀，立即置80℃水浴中加热30 min，取出，置冷水浴冷却5 min，于490 nm处测定吸光度，见表8，计算RSD为1.23%，说明该方法的重复性良好。

2.5.5 加样回收试验

分别精密量取供试品溶液0.5 mL，各加入对照品溶液 0.15、0.20、0.25 mL混匀，加水至2 mL，再加入4%的苯酚溶液1 mL及硫酸5 mL，摇匀，立即置80℃水浴中加热30 min，取出，置冷水浴冷却5 min，于490 nm处测定吸光度，见表9，计算回收率。结果证明，该方法准确性良好。

表8 重复性试验Talbe 8 Repeatability test

表9 加样回收试验Table 9 Recovery of added samples test

2.6 样品检测与分析

分别取不同批号的样品6份，按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，分别取供试品溶液1 mL，加水1 mL，再加入4%的苯酚溶液1 mL及硫酸5 mL，摇匀，立即置80℃水浴中加热30 min，取出，置冷水浴冷却5 min，于490 nm处测定吸光度，见表10。由此可见，每100 mL样品含多糖的量平均为0.388 g。

3 结论

苯酚-硫酸法测定参茸玉液酒中多糖方法稳定，精密度高，线性范围为0.02535mg/mL～0.05915mg/mL，相关系数为r2=0. 9993，平均回收率为100.44%。在本研究试验条件下，参茸玉液酒中多糖的最大吸收波长为490 nm。苯酚的浓度和硫酸的加入量对检测结果的影响较大，原因可能是苯酚和硫酸是本实验的显色剂，在定量加入苯酚的前提下，苯酚的浓度影响了显色反应的完全程度；而硫酸的加入量一方面影响了显色反应的完全程度，另一方面又影响了显色后络合物的浓度。本研究检测了浓度为2%～6%的苯酚溶液对吸光度的影响，发现苯酚浓度为4%时，供试品的吸光度值最大，因此，选择加入4%的苯酚溶液进行供试品溶液的制备；本研究还检测了硫酸的加入量为4 mL～7 mL时对吸光度的影响，发现供试品溶液在硫酸的加入量为5 mL时，吸光度值最大，故选择加入硫酸的量为5 mL。本研究结果显示，水浴温度在40℃～100℃范围内，水浴时间在15 min～40 min范围内，水浴温度和时间对吸光度值的影响不显著，但是为了保证显色反应完全，且方便操作，我们选择了最佳的水浴温度为80℃，加热时间为30 min。