响应面法优化脉冲强光杀灭干豆腐大肠杆菌条件的研究

王鑫垚，马 涛，王 勃，刘 贺，何余堂，惠丽娟

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110866；2.渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州 121013）

大豆是我国重要的粮食作物，也是我国居民膳食中优质蛋白质的重要来源。以大豆为主要原料制作而成的中国传统豆制品具有独特的口感、风味，营养丰富且易于消化吸收[1]。其中，干豆腐不仅可以即食也可以烹制菜肴，因此广受人们的喜爱。干豆腐富含人体所必需而自身又不能合成的8种氨基酸[2]，还含具有降低胆固醇作用的不饱和脂肪酸亚油酸和对神经系统有保健作用的维生素E和卵磷脂[3]。但是干豆腐的生产方式多为家庭手工作坊式生产，加工场所简陋，卫生状况差，在储存、运输、销售过程中容易二次污染[4]。此外，干豆腐的保质期很短，这在一定程度上影响了产品的品质和销售，也限制了其生产规模和产业发展[5]。

目前用于豆制品的保鲜技术主要有物理保鲜、化学保鲜和生物保鲜[6-8]。脉冲强光杀菌技术是近年来出现的利用瞬时、高强度的脉冲光能量进行快速灭菌的一种物理杀菌新技术[9]，它利用惰性气体灯发出与太阳光谱相近、波谱范围由紫外线至红外线区域的强烈脉冲闪光来杀灭固体表面、气体和透明液体中的微生物[10-12]。使用脉冲强光技术对食品杀菌，对食品的营养成分、色泽、风味和质地影响较小[13]，这对风味食品以及不适于高温灭菌的食品尤为重要。

本研究应用脉冲强光对干豆腐表面自然状态存在的大肠杆菌进行灭菌，然后利用响应面法优化灭菌条件。以大肠杆菌灭菌率为指标，脉冲强光能量、照射距离和照射时间为影响因素，采用Box-Behnken实验设计及响应面得到脉冲强光对干豆腐大肠杆菌的最优灭菌条件，以期为脉冲强光技术在豆制品灭菌中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干豆腐 于锦州当地市场购买，水分：60.5g/100g、蛋白质：18.8g/100g、脂肪：5.71g/100g；月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 北京奥博星生物技术有限责任公司。

AR224CN电子天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；YXQ-LS-75S11立式全自动压力灭菌锅 北京科创百万科技发展有限公司；DHG-9055A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 金坛市鑫鑫实验仪器厂；LA50-800H脉冲强光表面杀菌实验柜 宁波中物光电杀菌技术有限公司；SW-CJ-2FD洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；LRH-150生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；其中，实验所用的脉冲强光杀菌柜内安置有灯管可以产生脉冲强光，下方有一个石英板，可以上下调节距离，样品放在上面即可进行照射处理。

1.2 实验方法

将当天购买的干豆腐迅速放置在4℃条件下保藏，待实验开始前，在无菌条件下切分成长20cm，宽10cm的长方形。

1.2.1 脉冲强光能量对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响 设计照射距离为10cm，照射时间为15s，脉冲强光能量取100、200、300、400、500J，对干豆腐进行照射处理，未做处理的干豆腐作为空白对照。接着分别取样并制备菌悬液，先进行初发酵实验，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL，于36℃培养48h，观察小倒管内是否有气体产生。然后将产气的样品进行复发酵实验，用接种环从产气的LST肉汤管中取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃培养48h，观察产气情况。产气者为大肠菌群阳性管，记录大肠菌群阳性管数。

1.2.2 照射距离对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响 设计脉冲强光能量为300J，照射时间为15s，照射距离取8、9、10、11、12cm，对干豆腐进行照射处理，未做处理的干豆腐作为空白对照，分别取样并制备菌悬液，再按照1.2.1方法依次进行初发酵实验和复发酵实验，记录产气的大肠菌群阳性管数。

1.2.3 照射时间对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响 设计脉冲强光能量为300J，照射距离为10cm，照射时间取7、9、11、13、15、17、19s，对干豆腐进行照射处理，未做处理的干豆腐作为空白对照，分别取样并制备菌悬液，再按照1.2.1方法依次进行初发酵实验和复发酵实验，记录产气的大肠菌群阳性管数。

1.2.4 大肠菌群检验 根据食品安全国家标准GB 4789.3-2010食品微生物学检验：大肠菌群计数第一法：大肠菌群最可能数（MPN）计数法进行大肠菌群计数[14]。

1.2.5 灭菌率的计算 杀菌效果用灭菌率表示，计算公式[15]为：

式中：N—灭菌前的大肠菌群最可能数；N0—灭菌后的大肠菌群最可能数。

1.2.6 实验设计 根据Box-Benhnken实验设计原理，选择影响干豆腐大肠杆菌灭菌率（Y）的3个因素：脉冲强光能量（A）、照射距离（B）、照射时间（C）进行组合，以－1、0、1分别代表自变量的低、中、高水平，进行三因素三水平的实验设计，共17个实验点，5个中心点重复实验。

表1 实验因素及水平设计Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3 数据处理

利用Design Expert 8.0.6软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 脉冲强光能量对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响 如图1所示，较低的脉冲强光能量对干豆腐中大肠杆菌的杀灭效果相对较差。脉冲强光能量从100～300J，大肠杆菌灭菌率迅速提高，在实验范围内能量超过300J后灭菌率保持稳定。考虑到节约能源，选择脉冲强光能量300J为响应面实验的中心实验点。

图1 脉冲强光能量对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响Fig.1 Effect of pulsed light energy on E.coli sterilization rate of dry bean curd

2.1.2 照射距离对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响 如图2所示，脉冲强光照射距离为10cm时，大肠杆菌的灭菌率最大，可以达到98.26%，继续增大照射距离，发现距离过远对大肠杆菌的灭菌效果不好。因此，选择照射距离10cm为响应面实验的中心实验点。

图2 照射距离对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响Fig.2 Effect of irradiation distance on E.coli sterilization rate of dry bean curd

2.1.3 照射时间对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响 如图3所示，在选取的7个时间点上，脉冲强光照射时间在7～15s的范围内，大肠杆菌的灭菌率呈增加的趋势，在15s时达到97.95%。15～19s，灭菌率变化不明显。根据灭菌率，选择照射时间15s为响应面实验的中心实验点。

图3 照射时间对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响Fig.3 Effect of irradiation time on E.coli sterilization rate of dry bean curd

2.2 响应面法优化脉冲强光灭菌条件

2.2.1 模型的建立及其显著性检验 响应面实验设计及结果见表2。响应面法以最经济的方式，较少的实验次数和较短的时间对所选的实验参数进行全面研究。利用Design Expert 8.0.6软件对表2实验数据进行多元回归拟合，获得的响应值大肠杆菌灭菌率（Y）对自变量脉冲强光能量（A）、照射距离（B）和照射时间（C）的二次多项式回归模型方程：

Y=98.29+1.55A+1.08B+1.69C-1.43AB+0.63AC-2.09BC-6.03A2-4.86B2-10.46C2。

对回归模型进行方差分析，结果见表3。从表3中可以看出模型是极显著的（p＜0.0001），失拟项不显著，回归模型的决定系数R2=0.9941，说明该模型能够解释99.41%的响应值变化，仅有总变异的0.59%不能用该模型解释。模型拟合程度良好，实验误差小，因此可用此模型分析和预测经脉冲强光照射处理后干豆腐大肠杆菌的灭菌条件。

由表3回归方程系数显著性检验可知，模型一次项A、B、C、二次项A2、B2、C2极显著；交互相AB显著、BC极显著；交互项AC不显著。由p值显著性的大小可以看出，各实验因素对大肠杆菌灭菌率的影响大小顺序为：照射时间（C）＞脉冲强光能量（A）＞照射距离（B）。

表3 回归方程系数显著性检验Table 3 Significance test for regression coefficients

2.2.2 响应面分析与优化 回归模型方程的响应面分别见图4～图6。对响应面及等高线图进行分析，可以直观地看出优化区域和不同因素之间相互作用的程度[16]。此外，椭圆形等高线图表示两两之间的交互作用比较显著。

图4表示的是将照射时间控制在0水平，脉冲强光能量、照射距离对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响。脉冲强光能量和照射距离的交互作用对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响显著。图5显示出脉冲强光能量和照射时间对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响不显著。从图6可以看出照射距离和照射时间的交互作用对干豆腐大肠杆菌灭菌率的影响显著。在一定范围内，大肠杆菌的灭菌率随着照射时间的延长而显著增加。

图4 脉冲强光能量、照射距离对干豆腐大肠杆菌灭菌率影响响应面图Fig.4 Response surface of pulsed light energy，irradiation distance on sterilization rate of E.coli from dry bean curd

图5 脉冲强光能量、照射时间对干豆腐大肠杆菌灭菌率影响响应面图Fig.5 Response surface a of pulsed light energy，irradiation time on sterilization rate of E.coli from dry bean curd

图6 照射距离、照射时间对干豆腐大肠杆菌灭菌率影响响应面图Fig.6 Response surface of irradiation distance，irradiation time on sterilization rate of E.coli from dry bean curd

Design Expert 8.0.6软件优化获得干豆腐大肠杆菌的脉冲强光灭菌最优条件，在脉冲强光能量312J、照射距离10cm、照射时间15.2s时，大肠杆菌灭菌率为98.49%。考虑到现有脉冲强光设备的型号及实际操作的方便，将工艺参数调整为脉冲强光能量300J、照射距离10cm、照射时间15s。实际操作环境要保持无菌和低温，以防二次污染和微生物快速的生长繁殖。

2.2.3 回归模型的验证 通过响应面法优化脉冲强光杀灭干豆腐大肠杆菌的灭菌条件，在优化条件下进行实验，通过比较预测值和实验值验证模型的有效性[17]。采用调整后的参数进行实验，结果得到的灭菌率为98.29%。实验值与预测值98.49%相差很小，表明该模型可以较好地反映出脉冲强光对干豆腐大肠杆菌的杀菌效果，从而也证明了Box－Behnken响应面法优化干豆腐大肠杆菌的脉冲强光杀菌工艺的可行性。

3 结论

本研究采用实验设计软件Design Expert 8.0.6，根据Box-Behnken实验设计建立脉冲强光技术对干豆腐表面自然状态的大肠杆菌进行灭菌的二次多项数学模型，并优化出灭菌参数。实验得出影响大肠杆菌灭菌率的大小顺序为：照射时间＞脉冲强光能量＞照射距离；脉冲强光能量300J、照射距离10cm、照射时间15s。在该条件下大肠杆菌灭菌率可以达到98.29%。

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