细菌纤维素膜对木醋杆菌发酵制备苹果醋的影响研究

傅 亮，彭 英，陈宇哲

（暨南大学食品科学与工程系，广东广州 510632）

苹果醋是一种在国内广受欢迎的保健型饮品，主要由苹果汁与食醋调配而成。全发酵型苹果醋风味更自然，功能性更好，但工艺及质量控制较调配型产品复杂，目前尚未形成市场主流，是该产品发展的方向[1]。

前期工艺研究发现，以苹果汁为原料，使用葡萄酒酵母和自行从广式米醋车间分离的木醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）RF4为菌种制备的全发酵型苹果醋，风味特征显著优于配制型产品。目前，采用木醋杆菌进行表面好氧发酵酿制苹果醋的工艺、设备和质量控制研究未见报道，值得深入探讨。上述工艺实施中发现，发酵中后期液体表面会形成一层细菌纤维素膜，并随发酵时间的延长继续增厚，属于典型的表面好氧发酵形式。本文主要探讨细菌纤维素膜的形成、存在状态和完整性对苹果醋酿制产酸的影响，并初步探讨其机理，研究结果可为生产工艺的优化和设备设计提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

木醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）RF4[2]广州如丰果子食品公司分离的产酸菌；安琪果酒专用酵母 安琪酵母股份有限公司；都乐100%苹果汁 百事饮料广州公司；乙醇、氢氧化钠等 分析纯，天津市大茂生产。

HR-120型电子天平 上海精密；YQX-SG46-280S型高压蒸汽灭菌器 上海博迅；SW-CJ-1BU型超净工作台 苏州安泰；PYX-190-A型生化培养箱 上海跃进；UV-9200型可见光分光光度计 北京瑞利；AZ8403型便携式氧浓度测定仪 台湾衡欣；酸碱滴定装置。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种液及苹果酒的制备

1.2.1.1 木醋杆菌RF4菌种液的制备[3]1g/100mL葡萄糖、1g/100mL酵母粉，121℃灭菌20min，冷却至70℃左右加入5%的无水乙醇（V/V），冷却至室温后接种木醋杆菌RF4，30℃下培养7d（检测菌落数为7×103CFU/mL）。

1.2.1.2 苹果酒的酿制 称取干酵母按1∶10（w/w）的比例接于5%的无菌蔗糖液中，40℃活化20～30min。将苹果汁灭菌冷却至室温接种0.3%（w/w）的酵母液，30℃培养4d，糖度不再变化，酒精发酵结束，苹果酒酿制完成，测得酒精度为5.5%（v/v）。

1.2.2 分析测定方法

1.2.2.1 总糖测定 手持糖度计。

1.2.2.2 酒精度的测定[4]化学氧化法。

1.2.2.3 总酸的测定 参照GB/T 5009.41-2003。

1.2.2.4 乙醇脱氢酶（ADH）活力的测定[5]参照WOOD氏法。

1.2.2.5 溶氧量的测定 使用便携式溶氧仪。

1.2.3 细菌纤维素的形成对表面发酵产酸的影响向酿制好的苹果酒中接入10%（w/w）的RF4菌种液，30℃进行发酵，发酵分A、B、C、D四组方式进行。A、B、C三组静置发酵5d后，酸度达1.80g/100mL，发酵液面均形成结构稳定的细菌纤维素膜，A组继续保持静置培养；B组轻摇瓶身使膜沉入发酵液底部并静置培养；C组用无菌玻璃棒取出纤维素膜后静置培养。D组从发酵第1d开始每隔1h搅拌一次发酵液，阻止细菌纤维素在发酵液表面聚合成膜，因膜不能漂浮聚合发酵液呈浑浊状态。以上四组发酵方式每隔8h测一次酸度。

1.2.4 细菌纤维素膜与发酵液中乙醇脱氢酶活力的测定 培养7d后，分别测定A组的浮膜，B组沉入发酵液底部2d的膜，以及A组发酵液中乙醇脱氢酶的活性。

纤维素膜酶解液制备[6]：准确称量上述A、B两组发酵液中漂浮于液面和沉入液下的湿状纤维素膜0.25g，加入0.1%已活化好的纤维素酶溶液（最适条件下测得的酶活力为1556IU/g），用醋酸-醋酸钠缓冲溶液调至pH5.0，蒸馏水定容至10mL，35℃水浴24h至膜完全水解。

乙醇脱氢酶活性测定：参照WOOD氏法，各取pH4.0的Mcllvaine缓冲液1.0mL，体积分数10%TritonX-100溶液0.2mL，1.0mol/L乙醇溶液0.2mL，0.1mol/L铁氰化钾溶液0.2mL，分别加入乙醇培养发酵液及纤维素膜酶解液各0.4mL，置于25mL比色管，25℃保温5min，然后加入硫酸铁-Dupanol溶液（5g硫酸铁、3g十二醇硫酸钠、95mL 85%磷酸，蒸馏水定容至1L）1.0mL，再与7mL蒸馏水混合后，测定660nm处吸光度。25℃水浴20min后，再次测量，重复三次，取算术平均值。

酶活力单位定义：1min氧化1μmol的乙醇为1U；在上述条件下1g样品吸光度增加4.0等于氧化lμmol的乙醇，即1U/g。

酶活计算公式（U/g）：

式中，k：放大系数，发酵液为2.5，纤维素膜酶解液为100；ΔA：吸光度读数变化的绝对值；t：反应时间[7]。

1.2.5 两种不同接种方式对产酸的影响 将酿制好的苹果酒发酵液分成2组：A组接种发酵液重量10%的菌种液，B组接种发酵液重量的10%湿状菌纤维素膜，30℃静置培养，测量酸度的变化。

1.2.6 取膜后产酸速率与耗氧和ADH酶活力之间的关系 静置发酵5d后，酸度达到1.80g/100mL，以无菌玻棒将发酵液表面形成完整稳定的细菌纤维素膜取出，用铝箔和纱布将锥形瓶瓶口密封，每隔4h测定酸度、液面上空顶隙氧含量、发酵液ADH酶活力、发酵液与纤维素膜ADH酶总活力。由于发酵过程中细菌纤维素悬浮在液中并缓慢絮凝于液面上方，测定发酵液ADH酶活力时取样需来自底部澄清部分；ADH酶总活力测定，则需将细菌纤维素搅碎，使发酵液和细菌纤维素混合均匀后取样。

1.3 数据处理

每组实验均做3次平行，以3倍标准差法剔除异常值。实验结果以算术平均值表示。

2 结果与分析

2.1 细菌纤维素膜的形成及对产酸的影响

发酵过程中，D组每隔1h搅拌一下发酵液，一开始就阻止了纤维素膜的形成，酸度一直维持在初始的0.36g/100mL，产酸停滞；A组的细菌纤维素膜逐渐加厚；B和C组静置培养24h后可以观察到重新形成的完整纤维素薄膜浮于液面。

A、B、C三组重新计时后产酸情况如图1所示。

图1 发酵5d后纤维素膜的状态对酸度的影响Fig.1 The influence of states of the cellulose pellicle to acid production after fermentation 5 days

由图1可知，A组的纤维素膜没有被破坏，产酸能力一直保持较高水平，酸度逐渐上升，最高达4.32g/100mL，之后酸度开始下降；B与C组前16h几乎不产酸，之后酸度缓慢上升，在16～24h开始有肉眼可见的纤维素膜浮于液面，24h后B和C组可形成完整的纤维素膜，同时产酸能力迅速上升，这两组发酵液最高酸度同时达4.32g/100mL，但比A组慢8h左右。由此可知纤维素膜沉于液底或取出后都会抑制产酸，直到液面重新成膜后才恢复较高的产酸速度，纤维素膜的取出或下沉不会影响产酸的最高值，但是会影响达到最高酸度所需时间。

上述结果表明，纤维素膜的生成并且浮于发酵液表面对产酸有直接的相关关系，其存在与状态对产酸起重要作用。

2.2 纤维素膜内与发酵液中乙醇脱氢酶活性对比

图2 纤维素膜内与发酵液中乙醇脱氢酶活性对比Fig.2 The comparison of ADH enzyme activity in the cellulose pellicle and fermented liquor

由图2可知，纤维素膜内的乙醇脱氢酶活性远高于发酵液中，浮在液面的膜内乙醇脱氢酶的活力最大为0.7340U/g，而发酵液中酶活只有0.0132U/g；二者相差56倍。沉入液下的膜内乙醇脱氢酶活性为浮在液面的74.1%，为0.5440U/g。结果说明，将乙醇氧化生成乙酸起主要作用的乙醇脱氢酶主要集中在细菌纤维素膜内。

2.3 两种不同的接种方式对产酸的影响

图3 两种接种方式对产酸的影响Fig.3 The influence of the two inoculated methods to acid production

两种接种方式对产酸的影响如图3所示，发酵前3d木醋杆菌处于迟滞期，A、B两组的酸度几乎保持不变，但是从第4d开始，随着二者都在液面形成新的纤维素膜，接入含菌纤维素膜的B组产酸速度明显高于接入菌种液的A组，B组在第7d酸度达到4.32g/100mL，而A组在酒精发酵第8d才达到同样酸度，之后酸度均开始下降。结果表明，接入纤维素膜达到最高酸度的时间比接入液态菌种快。

2.4 取膜后继续发酵产酸速率、耗氧和ADH酶活力之间的关系

由表1可看出，在取出细菌纤维素膜的前16h，几乎不产酸，耗氧速率较慢，发酵液中ADH酶活力几乎不变，但ADH酶总活力在缓慢上升，伴随发酵液中浑浊度增加，显示纤维素产量增加，但细菌纤维素尚未在表面完整聚集。

16～20h，酸度上升明显，耗氧速率加快，发酵液中ADH酶活力缓慢上升，ADH酶总活力上升迅速。在20h时观察到纤维素在发酵液面开始聚集成膜，此时发酵液中ADH酶活力达到最高值0.333U/g，之后缓慢减弱。说明膜的形成伴随着ADH酶活向膜聚集，证据指向了膜为产酸的主要场所。

20～24h，ADH酶总活力继续增加，产酸速率达到最高的0.065g/100mL·h，耗氧速率也达到最大为0.383mg/L·h，24h时发酵液清澈透明，浑浊消失，清晰的观察到完整结实的细菌纤维素薄膜漂浮于液面，这说明完整而结实的细菌纤维素薄膜起着聚集支撑菌体和ADH酶的作用，并改善溶氧，强化产酸。

24h后，随着ADH酶总活力的提高，酸度继续上升，但是产酸速率和耗氧速率开始下降，应为瓶口密封，顶隙供氧不够所致。此时发酵液几乎完全透明，液面薄膜逐渐加厚。

3 结论与讨论

采用木醋杆菌进行表面发酵法酿制全发酵型苹果醋，产品品质良好，所使用的菌种及工艺尚未见文献报道。伴随苹果醋的发酵，形成的细菌纤维素膜是发酵的典型特征，本文对细菌纤维素膜在发酵产酸中的作用、机理进行了初步探讨，揭示了成膜对发酵的影响。

研究表明，浮于发酵液表面的灰白色细菌纤维素膜内ADH酶活力比发酵液中的高56倍，说明发酵产酸主要在膜内进行，膜的存在及在发酵液内所处状态也会极大的影响产酸，当膜浮在液体表面并保持完整时可使产酸状态达到最佳。接种含菌纤维素膜比接种液态菌种能减少产酸迟滞期，提早达到最高酸度也证实了这一点。

表1 产酸速率与耗氧、ADH酶活力之间的关系Table 1 The relationship of acid production rate，oxygen consumption and the ADH enzyme activity

与细胞膜结合的乙醇脱氢酶（ADH）是产酸过程中将乙醇氧化成乙醛，并进一步转化成乙酸的标志性酶，ADH活力的大小对产酸能力的评价起着最为关键的作用[8]。研究结果证实，纤维素在液体表面的聚集并成膜与产酸速率、耗氧速率及总ADH酶活力直接关联，膜形成的过程伴随着这些参数的显著性变化，更进一步证实了膜对发酵产酸的重要性。成膜及保持完整应是菌体及ADH的支撑系统，更有可能改变了发酵液表面特性，有助于溶氧。

根据本文的研究结果，以木醋杆菌RF4进行表面发酵制备苹果醋，工艺中应特别考虑维持膜的快速形成并维持完整。该结论在设备设计及选型过程中有重要的指导作用。常用的好氧发酵设备，如深层液态搅拌式发酵罐或气升式反应器，因其生产过程中发酵液内存在较大剪切力可能导致细菌纤维素膜不能良好形成或被破坏导致发酵失败。维持纤维素膜完整条件下连续好氧发酵罐的设计是新型表面好氧发酵设备设计的新课题。

[1]王云阳，岳田利，袁亚红，等.苹果醋及果醋饮料的研制[J].食品工业科技，2005（4）：118-120.

[2]傅亮，易九龙，陈思谦，等.传统广式米醋中醋酸菌的分离与鉴定[J].中国调味品，2012，37（6）：57-60.

[3]傅亮，易九龙，陈思谦，等.木醋杆菌RF4分批补料发酵法生产广式米醋[J].食品与机械，2013，29（1）：202-204.

[4]郭美利，马美范.饮料酒中酒精含量的分析方法研究[J].东轻工业学院学报，2008，22（3）：14-17.

[5]Willis A.Wood：Methods in Enzymology[M].Washington，D C：Acodenic Press，982：450-451.

[6]贾士儒，欧竑宇，马霞，等.细菌纤维素结构与性质的初步研究[J].纤维素科学与技术，2002，10（3）：25-29.

[7]傅亮，陈思谦，易九龙，等.细菌纤维素膜对木醋杆菌发酵生产广式米醋的影响[J].食品与发酵工业，2012，38（4）：123-125.

[8]周秉承.食醋生产中醋酸菌乙醇脱氢酶的活性与产酸速率关系的研究[J].中国酿造，2009（11）：58-59.