不同温度贮藏对中国樱桃软化进程中果胶及相关酶的影响

赵胜锦，张 放

（浙江大学果树科学研究所，浙江杭州 310058）

中国樱桃（Prunus psedoerasus Lindl.）属于蔷薇科落叶乔木果树，是我国南方主栽的樱桃种类。其果实味美形娇，营养丰富，但采后易迅速软化，不利于贮运。软化是果实从成熟到衰老的必然生理过程，表现为果肉硬度下降、质地变软、果胶物质降解、细胞壁酶活性变化[1-2]等。低温贮藏是延长果实贮藏期的常用方法，降低温度能显著抑制果实呼吸、后熟、衰老和腐烂，有效控制果实成熟、保持果实品质、延长果实寿命[3]，其中近生物冰点贮藏能最大程度延长水果的贮藏期[4-5]。目前国内外有关低温贮藏对采后果实生理影响已在香蕉[6]、桃[7-8]、荔枝[9]、甜樱桃[10]、蓝莓[11]等水果上有所报道。而中国樱桃在这方面的研究报道较少，对其采后软化生理变化过程知之甚少。本文以中国樱桃为研究对象，探讨不同温度贮藏下果实呼吸生理和贮藏品质的变化特点，以及对果胶组分和相关酶活性的影响。研究结果可进一步揭示不同温度贮藏果胶组分及果胶酶的变化特点，探讨中国樱桃采后软化机理，为其贮运保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中国樱桃 品种为‘乌皮樱桃’，2013年5月采自浙江诸暨市（同山镇中源村）樱桃园，选择树龄5年、长势基本一致的樱桃树，采收成熟度以果实鲜红为基准，对树冠中部的果实进行采收，采后立即运回浙江大学实验室，进行预冷，选择大小均匀、成熟度一致、无机械损伤、无病虫害的果实，按每袋200g装入樱桃专用薄膜袋。

UV-2550紫外分光光度计 日本SHIMADZU（岛津）公司；CheckpointⅡO2/CO2检测仪 丹麦PBIDansensor（丹圣）公司；MiniScan EZ-MSEZ便携式色差仪 美国HunterLab（亨特立）公司；TA-XT Plus物性分析仪 英国Stable Micro Systems公司；AtagoN-1a手持折光仪 日本ATAGO（爱拓）公司；5804R台式冷冻离心机德国Eppendorf（艾本德）公司；XMT-102温度数显调节仪 余姚金电仪表有限公司；BS323S精密电子天平 德国赛多利斯公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 将采后的中国樱桃分别置于（0±0.5）、（4±0.5）、（20±0.5）℃冰柜中贮藏，相对湿度90%～95%。取样时间为采后0、2、4、6、8、12、16d，测定果实生理指标；其余果实去核、液氮冷冻并置于-40℃贮藏待测。

1.2.2 果实生理指标的测定

1.2.2.1 呼吸速率的测定 将果实置于密闭容器1h，用O2/CO2检测仪测定CO2含量，单位以mg/（kg·h）表示。

1.2.2.2 腐烂率的测定 果实表面有腐烂斑点者为腐烂果，计算公式：腐烂率（%）=（腐烂果/调查总果数）×100[12]。

1.2.2.4 果肉硬度的测定 用物性分析仪测定果实去皮硬度，圆形探头直径5mm，测试深度4mm，贯入速度1mm/s对缝合线两侧果面进行去皮测定。

1.2.2.5 可溶性固形物的测定 用手持折光仪测定可溶性固形物。

1.2.2.6 可滴定酸的测定 用0.1mol/L NaOH滴定至pH达到8.2，结果转化为苹果酸等价物[7]。

1.2.3 果胶的提取与测定 将中国樱桃研磨成匀浆，用95%乙醇进行多次沸水浴，以Molish反应判断样品中已去除糖分，提取乙醇不溶物（AIS）[8，13]，真空干燥。取100mgAIS，用ddH2O和50mmol/L Na2CO3（含20mmol/L NaBH4）先后提取水溶性果胶（WSP）和原果胶（SSP）[14]。WSP和SSP含量的测定采用咔唑比色法在波长530nm测定OD值，以半乳糖醛酸制作标准曲线[15]。

1.2.4 细胞壁相关酶的提取与测定 多聚半乳糖醛酸酶（PG）的提取：取2.5g果肉，用1.0mol/L NaCl（pH6.0）4℃振荡提取30min，上清液用饱和（NH4）2SO4溶液盐析[16-17]，沉淀再溶于0.15mol/L NaCl（pH6.0）得提取液。酶活性测定以多聚半乳糖醛酸（PGA）为底物，用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定反应生成的D-半乳糖醛酸含量，测定条件：波长540nm，VDNS/V总体系=4/8，反应温度100℃，反应时间5min，酶活性单位U=mg/（g·h）[18]。β-半乳糖苷酶（β-Gal）提取：取2.5g果肉，用1.0mol/L NaCl（pH6.0）4℃振荡提取30min，上清液即酶提取液。酶活测定以对硝基酚半乳糖苷（PNPG，美国Sigma公司）为底物，37℃反应15min，用10mmol/L Na2B4O7终止反应，在波长400nm测定反应生成的对硝基苯酚含量，酶活性单位U=nmol/（g·min）[19]。

1.3 数据统计与分析

以上每组处理设置3次重复，实验数据用Excel 2003进行统计分析，计算标准偏差（±SE）；并使用SAS软件分别对硬度与WSP、SSP，WSP、SSP与PG、β-Gal进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同温度贮藏对中国樱桃生理指标的影响

2.1.1 对腐烂率的影响 中国樱桃在20℃贮藏下腐烂率上升最快，至第4d时达到100%，完全失去贮藏性，说明中国樱桃不耐贮藏。因此，本实验对中国樱桃20℃贮藏4d后的相关生理指标不再进行测定（图1）。20℃贮藏第1d中国樱桃就开始腐烂，在4℃贮藏下则推迟4d才出现腐烂现象，而在0℃贮藏前8d均无腐烂发生，说明降低贮藏温度能推迟腐烂的发生，且温度越低越迟出现腐烂。中国樱桃在4℃贮藏第8d后，腐烂率开始迅速上升，至第16d时达到64.62%，果实品质显著下降。而0℃贮藏第16d时腐烂率仅为9.45%，未失去贮藏性，说明0℃比4℃更有利于中国樱桃贮藏，且其贮藏时间不低于16d。

图1 不同温度贮藏下中国樱桃腐烂率的变化Fig.1 Changes in rotting rate of Chinese cherry fruit during different temperature storage

2.1.2 对呼吸速率的影响 呼吸速率与果实成熟衰老密切相关，采后呼吸作用越旺盛，各种生理生化进程就越快，货架寿命就越短[20]。中国樱桃采收时呼吸速率为12.95mg/（kg·h），20℃贮藏下呼吸速率急速上升，在第2d达到最大值19.85mg/（kg·h），比采收时上升53.31%，而在4℃和0℃贮藏下分别推迟2d和6d出现呼吸高峰，且呼吸速率值均远远低于20℃呼吸高峰，推测中国樱桃呼吸类型属于晚峰型（Late Peak Type）[3]，贮藏温度不会影响呼吸高峰的出现，但温度降低其呼吸速率越小（图2）。贮藏温度越低，中国樱桃的呼吸速率下降越显著。4℃贮藏第2d时中国樱桃呼吸速率为6.37mg/（kg·h），比采收时下降50.84%，0℃贮藏第4d时达到最小值2.49mg/（kg·h），比采收时下降80.77%，因此低温抑制呼吸速率是抑制果实腐烂、延长贮藏时间的重要因素。

图2 不同温度贮藏下中国樱桃呼吸速率的变化Fig.2 Changes in respiration rate of Chinese cherry fruit during different temperature storage

2.1.3 对果肉硬度的影响 硬度下降是果实软化最主要的直观表现。中国樱桃采收硬度不高，为1.86N。20℃贮藏下，中国樱桃果肉硬度下降最迅速，至第4d时降至1.36N，平均日下降11.83%，说明中国樱桃采后果肉硬度下降迅速，不耐贮藏（图3）。而在4℃贮藏下，中国樱桃果肉硬度在前6d无明显变化，但在贮藏后期有所下降，至第16d时降至1.40N，说明降低贮藏温度能延缓中国樱桃采后果肉硬度下降。在0℃整个贮藏过程中，果肉硬度均保持较高水平，且在贮藏前6d有所上升，贮藏后期无明显下降，这与甜樱桃在近生物冰点贮藏下果肉硬度变化的结果一致[5]。

图3 不同温度贮藏下中国樱桃果肉硬度的变化Fig.3 Changes in fresh firmness of Chinese cherry fruit during different temperature storage

2.1.4 对果皮色差的影响 色差是评价果实成熟度和品质的重要指标。采收时中国樱桃果皮呈鲜红色，总色差值（△E）为65.13，在20℃贮藏4d后明显上升至68.93，这是因为果皮红色不断加深所导致（表1）。在4℃贮藏下，△E在第4d短暂下降后持续上升至70.02（6d），并保持在较高水平，说明4℃贮藏无法抑制果皮色泽向暗红色转变。在0℃贮藏下中国樱桃在第4～8d内明显下降，但之后迅速上升至69.71，说明0℃能在贮藏前期延缓果皮色泽变暗。

2.1.5 对可溶性固形物和可滴定酸的影响 果实风味是评价商品价值的重要指标，主要用糖酸比来表示，可溶性固形物（TSS）和可滴定酸（TA）含量发生变化均会产生影响。采收时中国樱桃糖酸比为8.07，20℃贮藏2d后上升并保持在10.85左右，其原因为TA持续下降、而TSS则先上升后下降（表2）。随着贮藏温度的下降，TSS上升和TA下降的趋势均变缓，因此糖酸比在4℃和0℃贮藏分别在6d和8d后才快速上升。在4℃和0℃贮藏16d时，糖酸比均达到最大值13.55和14.55，主要是因为TA持续下降而TSS含量仍保持在较高水平。

2.2 不同温度贮藏对中国樱桃果胶变化的影响

研究认为，果胶酶及其引起的果胶组成的变化是细胞间粘合力下降的主要原因[21]。中国樱桃果实中原果胶（SSP）在采收时的含量最高，达到15.82mg/100mgAIS，水溶性果胶（WSP）含量则最低，为4.22mg/100mgAIS（图4）。伴随着果实硬度下降，中国樱桃的SSP不断降解为WSP，WSP不断升高。相关性分析表明，SSP与硬度变化呈正相关（r=0.74），而WSP与硬度变化呈负相关（r=-0.58），说明果实硬度下降与WSP和SSP含量的变化有关，推测果胶降解导致细胞结构受损，从而导致果肉硬度迅速下降。20℃贮藏下SSP降解为WSP最为迅速。如图4所示，20℃贮藏下SSP平均日下降7.48%，WSP前3d平均日上升21.13%，但在第4d时WSP明显下降，这可能与果实腐烂，细胞结构受到严重破坏有关。4℃贮藏下，SSP贮藏前12d平均日下降2.50%，WSP平均日上升2.94%，说明降低温度能显著抑制WSP上升和SSP下降的速率。而在0℃贮藏过程中，SSP在贮藏前4d无明显变化，贮藏6d后含量有明显上升趋势，之后开始迅速下降，但仍高于4℃同期；WSP在贮藏前4d呈明显下降趋势，在第4d达到最小值2.92mg/100mgAIS，比4℃条件下低31.69%，之后又迅速上升，在第12d时达到4℃相同水平。这些结果说明，低温能有效地抑制SSP的下降和WSP含量的上升，而且在贮藏前期更为明显。

表1 不同温度贮藏下中国樱桃色差的变化Table 1 Changes in Chromatic aberration of Chinese cherry fruit during different temperature storage

表2 不同温度贮藏下中国樱桃可溶性固形物和可滴定酸含量的变化Table 2 Changes in TSS and TA of Chinese cherry fruit during different temperature storage

图4 不同温度贮藏下中国樱桃果胶的变化Fig.4 Changes in pectin of Chinese cherry fruit during different temperature storage

2.3 不同温度贮藏对中国樱桃果胶酶活性的影响

多聚半乳糖醛酸酶（PG）和β-半乳糖苷酶（β-Gal）被认为与许多果实软化密切相关，如桃[7，22-23]、青梅[14]、梨[24-25]等，但不同果实中PG和β-Gal活性变化不同，如PG在整个成熟期均不对酸樱桃软化起作用[26]，但却是甜樱桃软化主导酶之一[27]。相关性分析的结果表明，中国樱桃果实PG和β-Gal与SSP（rPG=-0.64、rβ-Gal=-0.73）存在负相关，与WSP（rPG=0.87、rβ-Gal=0.83）正相关，说明PG和β-Gal与SSP降解为WSP密切相关，是导致果实硬度下降的重要原因。中国樱桃20℃条件贮藏，PG和β-Gal活性均迅速上升，第3d时均达到最大值，为0.63mg/（g·h）和30.77nmol/（g·min），分别是采收时的1.16倍和2.17倍。贮藏第4d时PG和β-Gal活性均显著下降，这可能与果实腐烂有关。在低温贮藏下PG和β-Gal活性均受到不同程度抑制。0℃贮藏时PG活性显著下降，与段学武等[6]报道的冷激处理抑制香蕉的PG酶活性的结果一致，第2d迅速降至0.47mg/（g·h），直至第8d后才开始明显上升，而在4℃贮藏下PG活性在第6d后就开始上升，说明温度越低越能抑制PG酶活性（图5）。低温对β-Gal酶活性抑制作用更为明显，0℃对β-Gal活性抑制最为显著，在贮藏第4d达到最小值8.56nmol/（g·min），远低于4℃条件下贮藏，β-Gal活性。4℃贮藏较好抑制了贮藏前期的β-Gal活性，但第8d后β-Gal活性迅速上升至第12d达到最大值30.68nmol/（g·min），远高于0℃贮藏下β-Gal活性水平（图6）。以上结果说明，PG和β-Gal是参与中国樱桃果实软化的重要酶，其酶活性的升高很有可能是引起原果胶降解的重要原因，贮藏温度越低越能抑制其活性，从而延缓果胶物质降解，延长贮藏时间。与PG相比，β-Gal与果胶组分变化关系更为密切，对低温抑制也更敏感，与中国樱桃软化密切相关。

图5 不同温度贮藏下中国樱桃多聚半乳糖醛酸酶的变化Fig.5 Changes in PG of Chinese cherry fruit during different temperature storage

图6 不同温度贮藏下中国樱桃β-半乳糖苷酶的变化Fig.6 Changes in β-Gal of Chinese cherry fruit during different temperature storage

3 结论

本研究的结果表明，低温贮藏可显著抑制中国樱桃采后呼吸速率，降低腐烂率，延长贮藏时间，该结果与甜樱桃[5]、桃[28]表现一致。降低贮藏温度能明显抑制中国樱桃软化进程，主要原因是低温延缓了PG和β-Gal酶活性上升，进而抑制了果胶的降解，对保持中国樱桃硬度起到重要作用。0℃贮藏对抑制中国樱桃果实采后呼吸速率和腐烂率的效果明显优于4℃，但对果皮色差和糖酸比等贮藏品质的影响区别不大。

综上所述，低温贮藏在整体上有利于抑制果实腐烂、延长贮藏时间、维持果实品质。从贮藏效果和生产成本等综合考虑，0℃贮藏更适宜于中国樱桃贮藏，可以推广应用于实际生产。

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