食品大肠菌群间接计数法在水质大肠菌群监测中的应用效果

赵卫红　徐秋琴　裴拥军　毛云斌　黄曾　邹锦群　詹卓蓬

[摘要]目的 探討GB 4789.3-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》中的间接计数法（MPN法）检测水质大肠菌群的效果。方法 采集2017年10月～2018年4月丰城市城市生活饮用水、农村生活饮用水、水库水、水源水等各类水质，利用GB 4789.3-2016中的MPN法与GB/T 5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》中的总大肠菌群MPN法检测水质大肠菌群，验证两种方法检测水质大肠菌群的关联性，比较分析两种方法检测每项阳性样本所花费的人力、物力、费用、时间以及大肠菌群阳性率。结果 两种MPN法检测水质大肠菌群的一致性较好（Kappa=0.97）;两种MPN法检测水质大肠菌群的阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）;食品大肠菌群MPN法的仪器耗损费、试剂费用、消耗人力费用均低于水质大肠菌群MPN法，消耗时间短于水质大肠菌群MPN法，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 食品大肠菌群MPN法可替代水质大肠菌群MPN法用于水质大肠菌群的检测，可大大节省人力、物力、财力。

[关键词] GB 4789.3-2016间接计数法;GB/T 5750.12-2006间接计数法;人力消耗;物力消耗;时间消耗

[中图分类号] R123.1     [文献标识码] A     [文章编号] 1674-4721（2020）3（b）-0159-04

Application effect of food coliform indirect counting method in water quality coliform monitoring

ZHAO Wei-hong   XU Qiu-qin   PEI Yong-jun   MAO Yun-bin   HUANG Zeng  ZOU Jin-qun   ZHAN Zhuo-peng

Department of Clinical Laboratory， Fengcheng Center for Disease Control and Prevention in Jiangxi Province， Fengcheng   331100， China

[Abstract] Objective To explore the effect of indirect counting method （MPN method） in GB 4789.3-2016 "National Food Safety Standard for food microbiology test—Coliforms Count" on detecting coliforms in water. Methods The water samples were inciuded urban drinking water， rural drinking water， reservoir water， and water source from Fengcheng city from October 2017 to April 2018. The coliforms in water were detected by the MPN method in GB 4789.3-2016 and the total coliforms MPN method in GB/T 5750.12-2006 "Standard examination methods for drinking water—Microbilolgical parameters"， separately. The correlation between the two methods for detecting coliform bacteria was verified. The manpower， material resources， cost， time and the positive rate of coliform bacteria detected by the two methods were compared. Results The consistency of two MPN methods to detect coliform group in water quality was good （Kappa=0.97）. There was no significant difference in the positive rate of coliform detected by two MPN methods （P>0.05）. The instrument cost， reagent cost and labor cost of food coliform group MPN method were lower than those of water coliform group MPN method， and the consumption time was shorter than that of water coliform group MPN method， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion MPN method of food coliform group can replace MPN method of water coliform group to detect coliform group of water quality， which can greatly save manpower， material and financial resources.

[Key words] GB 4789.3-2016 indirect counting method; GB/T 5750.12-2006 indirect counting method; Labor consumption; Material consumption; Time consumption

大肠菌群为水质卫生监测的指示菌[1]，实现其快速检测具有重要的卫生学意义。目前，对于大肠菌群快速检测的方法大部分是基于对其核酸的分子生物学检测，这些技术对实验条件的要求高，价格昂贵，因此限制了其应用[2]。目前普遍采用的水质大肠菌群间接计数法（MPN法）较食品大肠菌群MPN法操作步骤多，繁杂，且工作量较大[3]。本研究将食品大肠菌群MPN法用于水质大肠菌群的检测，验证实试验验证大肠菌群的检测效果，对照水质大肠菌群MPN法的检测时间、消耗的人力、物力以及大肠菌群检出率，旨在探讨食品大肠菌群MPN法用于水质大肠菌群检测的应用价值，现报道如下。

1材料与方法

1.1样本与试剂

采集2017年10月～2018年4月丰城市城市生活饮用水、农村生活饮用水、水库水、水源水等各类水质，试剂包括：乳糖蛋白胨培养液、革兰染色液、伊红美蓝琼脂、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤（青岛高科技园海博生物技术有限公司）。

1.2仪器与设备

YC-180澳柯玛冰箱（澳柯玛股份有限公司）、 JM-A电子天平（诸暨市超泽衡器设备有限公司）、BSC-1300ⅡA2生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）、CJV1500T洁净工作台（山东新华医疗器械厂）、LMQ.C立式灭菌器（山东新华医疗器械厂）、5V电动移液枪（DLAB Scientific Inc）。

1.3方法

1.3.1检测前准备  高压灭菌消毒采水容器，将水样本置入容器中，在6 h内送到检测实验室。

1.3.2水质大肠菌群检测方法  采用GB/T5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》中的总大肠菌群MPN法。用灭菌吸管取10 ml水样接种到10 ml双料乳糖蛋白胨培养液中，用灭菌吸管取1 ml水样接种到10 ml单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1 ml水样加到9 ml生理盐水中混匀，用1 ml灭菌吸管注入到10 ml单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管，总共15管。

将接种管置于（36±1）℃培养箱内，培养（24±2）h，如有产酸、产气管，分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于（36±1）℃培养箱内培养18～24 h，符合深紫黑色，有金属光泽;紫黑色带或略带金属光泽;淡紫红色，中心较深的菌落，做革兰染色、镜检、证实实验。计大肠菌群阳性管数，查MPN表得出大肠菌群最可能数（MPN）值。

1.3.3食品大肠菌群检测方法  采用GB 4789.3-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验  大肠菌群计数》中的MPN法检测。用灭菌吸管取10 ml水样接种到10 ml LST肉汤管培养液中，用灭菌吸管取1 ml水样接种到10 ml LST肉汤管培养液中，另取1 ml水样加到9 ml生理盐水中混匀，用灭菌吸管取1 ml水样接种到10 ml LST肉汤管培养液中，每一稀释度接种3管，总共9管。

将接种管置于（36±1）℃培养箱内，培养24～48 h，产气管进行复发酵试验，取培养物1环，移种于BGLB肉汤管中，（36±1）℃培养（48±12） h，计大肠菌群阳性管数，查MPN表得出大肠菌群MPN值。

1.3.4两种方法的一致性检验  采用统计学Kappa检验验证GB 4789.3-2016中的MPN法与GB/T 5750.12-2006中的总大肠菌群MPN法检测水质中大肠菌群的一致性，证明两种方法均能用于水质中大肠菌群的检测。

1.4观察指标

比较两种方法检测每项阳性样本所花费的人力、物力、费用、时间，评价两种方法大肠菌群的检测效果，并分析两种方法检测的大肠菌群阳性率。

1.5统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义;采用Kappa值检验一致性，Kappa≥0.75提示一致性较好。

2.结果

2.1两种MPN法检测水质大肠菌群的一致性

两种MPN法检测水质大肠菌群的一致性较好（Kappa=0.97）（表1）。

2.2两种MPN法检测水质大肠菌群阳性率的比较

两种MPN法检测水质大肠菌群的阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

2.3两种MPN法所耗成本的比较

食品大肠菌群MPN法的仪器耗损费、试剂费用、消耗人力费用均低于水质大肠菌群MPN法，消耗时间短于水质大肠菌群MPN法，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。

3讨论

大肠菌群是公认的水质卫生监测指示菌[4-5]，便利、快速、廉价的检测方法对确保水质的卫生至关重要。目前国内外对于大肠菌群快速检测方法很多，这些方法包括核酸杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）及其衍生技术、基于16SrRNA与GyaB的检测技术[1]、化二硫化钼（MoS2）纳米片的光纤表面等离子体共振免疫传感器快速检测技术[6]、流式细胞阻抗仪检测[7]、组合的单砷化丙啶染色和定量PCR檢测[8]、智能手机的凝胶环介导的等温扩（gLAMP）系统[9]、人类致病菌下一代测序[10]、氯酚的生物降解[11]、生物物传感器蛋白子弹快速检测饮用水中大肠杆菌的荧光方法[12]、快速检测体细胞噬菌体的方法（Bluephage法）[13]、浓缩和免疫检测法[14]等，这些方法快捷、精确，但需要高精仪器与设备，费用也非常昂贵，不适宜在基层疾控中心应用。

一般水质大肠菌群检测，常规采用国标GB/T 5750.12-2006中的MPN检测方法，但此法耗费的人力、物力很高、时间较长。本研究采用食品国标GB 4789.3-2016中的MPN检测方法，用于检测水质的大肠菌群，经过两种方法检测大肠菌群的关联性检验，结果显示，两种MPN法检测水质大肠菌群的一致性较好（Kappa=0.97），提示两种方法均能用于大肠菌群的检测，且通过两种方法大肠菌群的检出率对比分析，结果显示，两种MPN法检测水质大肠菌群的阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。提示食品大肠菌群MPN法用于水质大肠菌群的检测有一定的可行性。本研究結果还显示，食品大肠菌群MPN法的仪器耗损费、试剂费用、消耗人力费用均低于水质大肠菌群MPN法，消耗时间短于水质大肠菌群MPN法，差异有统计学意义（P<0.05），提示食品大肠菌群MPN法具有较好的经济及时间效益[15]。

综上所述，两种方法检出的大肠菌群阳性率基本一致，而GB/T 5750.12-2006中的MPN检测方法需要比食品GB 4789.3-2016中的MPN检测方法更多的人力、物力、财力，且操作繁琐，花费的时间较长。因此，基层疾控单位采用食品GB 4789.3-2016中的MPN法替代GB/T 5750.12-2006中的MPN法检测水质中的大肠菌群，可以因地制宜、操作方便、节省开支与时间。

[参考文献]

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（收稿日期：2019-07-23  本文编辑：闫  佩）