FMOC-Cl柱前衍生高效液相色谱法测定乳中庆大霉素

赵静， 钱镭， 刘鹏

(1.黑龙江东方学院 食品与环境工程学部，哈尔滨 150086；2.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨 150028)

0 引 言

庆大霉素属于氨基糖苷类抗生素，抗菌活性强，主要作用于革兰氏阴性菌，常用于治疗细菌感染，又因其廉价易得而得到广泛的应用[1-4]中国农业部对动物性食品中庆大霉素残留的检测采用的是高效液相色谱法，以OPA为衍生剂进行柱后衍生[5]，但方法的重复性较差，灵敏度较低，检测时间较长，由于OPA本身稳定性较差[6-8]，衍生化试剂需临时配制，且衍生产物也较易发生分解[9-11]。因此，为了方便乳及乳制品中抗生素残留的日常监测，需要建立能够快速测定庆大霉素的简单的检测方法。

本研究采用相对稳定的氯甲酸芴甲酯为衍生剂，进行柱前衍生，并对衍生条件进行了优化，旨在建立一种能同时提取并净化原料奶中庆大霉素的前处理方法，以期建立简单，快速的庆大霉素残留检测技术。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

Waters2695高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、Empower色谱工作站，配Waters2475荧光检测器；QL-901型振荡器；Oasis MCX (mixed-modecation exchange)固相萃取柱；电子天平；离心机；氮吹仪；水浴锅；酸度计等。

1.2 材料试剂

庆大霉素标物质(≥99%)：国家标准物质研究中心；乙腈(色谱纯),天津科密欧公司；正己烷；庚烷磺酸钠；氢氧化钾；硼酸；磷酸氢二钠；磷酸二氢钠；氯化钠；三氯乙酸；氯甲酸芴甲酯；甘氨酸；实验用水均为三级水；

庆大霉素标准溶液：准确称取庆大霉素标准品0.050mg,甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中,摇匀，配成质量浓度为1.000 g/L标准贮备溶液，使用时按需要制成相应的标准工作液。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为30℃；检测器为荧光检测器；激发波长为350 nm、发射波长为450 nm；流动相：乙腈-水(75:25,V/V)；流速1.0 mL/min；进样量为10 μL。

1.3.2 样品预处理

取庆大霉素标准溶液2 mL于指形瓶中，加入2 mL 0.4 mol/L的硼酸缓冲溶液，加入0.4 mL氯甲酸芴甲酯衍生试剂，震荡，暗处反应30 min，加入120 μL的甘氨酸溶液终止反应，待上机分析。

1.3.3 标准曲线的制备

将庆大霉素标准储备液，依次稀释为5，25，50，75，100，200，500 mg/L的标准工作液， 柱前衍生化处理后，取10 μL进样，每个标准溶液重复进样3次，以标准溶液浓度水平为横坐标，以待测物色谱图的平均峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 方法的专属性

将空白辅料溶液、标准溶液、供试品溶液按样品预处理方法项操作，分别进样10 μL，获得相应的色谱图。

1.3.5 精密度和准确度的测定

分别在同一天和连续5 d测定质量浓度为25，100，500 mg/L的庆大霉素标准工作液，每个质量浓度设5个重复，根据日内与日间变异系数评价方法的精密度和准确度。

1.3.6 稳定性实验

庆大霉素供试品溶液经过样品处理衍生后，每隔2 h进样一次，每次进3针。

1.3.7 方法回收率实验

空白辅料中加入质量浓度分别为25，100，500 mg/L的标准溶液，每一质量浓度进行 5个样本分析，取10 μL进样分析，获得相应的峰面积。

1.3.8 灵敏度考察

向空白辅料中添加不同浓度的相应标准品溶液，以信噪比S/N=3时的最低质量浓度为最低检测限，S/N=10时的最低质量浓度为最低定量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

C18和C8色谱柱均可用于庆大霉素的检测[12]，本实验采用C18柱。调整流动相乙腈与水的比例发现，随着乙腈比例的减少，庆大霉素出峰的时间会延长，出峰时间过早不利于庆大霉素残留的充分检出，可能会有杂质干扰，出峰时间过长，不利于快速检测，综合考虑，选择乙腈与水的最优比例为75:25，不仅可以排除杂质的干扰，同时可在较短的时间内将庆大霉素检测出来。

2.2 衍生条件的优化

本研究中对不同的衍生条件进行了单因素优化，结果发现，缓冲溶液浓度为0.4 mol/L，pH值为12.0，衍生时间30 min时，可以到达最高的响应值。

2.3 标准曲线的绘制

将稀释以后的庆大霉素溶液，分别上机测定，以得出的峰面积的平均值为纵坐标，上机所用庆大霉素溶液浓度为横坐标绘制标准曲线如图1所示。

图1 庆大霉素标准曲线

2.4 方法的专属性

在上述色谱条件下，空白、加标样品和标准品的色谱如图2～图4所示。由图4可以看出，庆大霉素的保留时间是5.18 min，图2和图3说明空白样品中的物质对庆大霉素的检测没有干扰。

图2 空白奶样色谱

图3 空白奶样加庆大霉素标准品色谱

图4 庆大霉素标准工作液色谱

2.5 精确度和准确度实验

分别选取了高、中、低三个浓度梯度的庆大霉素溶液，做日内和日间准确度和精密度实验，结果如表1所示。由表1可以看出，该方法准确度良好，精确度符合实验要求。

2.6 稳定性实验

庆大霉素供试溶液每隔2 h进样一次，结果表明8 h内可获得稳定的测定结果，相对标准偏差为2.25%，稳定性良好。

表1 庆大霉素在牛奶中的精密度和准确度

2.7 方法回收率实验

向空白牛奶中加入标准庆大霉素溶液，使庆大霉素质量浓度为25，50，100 mg/L，并上机测定，得出方法回收率如表2所示。

表2 牛奶中庆大霉素的方法回收率

2.8 灵敏度实验

根据信噪比(S/N)的值来确定最低定性检测限和最低定量检测限，结果表明该方法最低定性检出限为0.15 mg/L，定量检出限为0.35 mg/L。

3 讨 论

本研究以乙腈与水为流动相，采用FMOC-Cl为衍生剂进行衍生，利用C18色谱柱进行分离检测，可以较好地检测出庆大霉素。该检测方法中衍生条件温和，可在室温条件下操作，无需进行水浴加热，降低了衍生温度对实验结果的影响，并且衍生物稳定性较好，时间长达8 h，同时该方法灵敏度较高，最低定量检测限为0.35 mg/L，定性检测限为0.15 mg/L，所以该方法更适合乳中庆大霉素的检测。

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