胰蛋白酶水解制备胰酪胨的工艺条件研究

齐奇，刘河涛，杨文君，王银，余建强

(宁夏医科大学 a.基础医学院；b.药学院，银川 750004)

0 引 言

牛乳中含有大量的蛋白质,其质量分数约为牛乳的3.3%～3.5%。主要有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳铁蛋白和一些具有重要生理功能的酶类,其中酪蛋白占78.8%，酪蛋白经酶促水解后可以产生相应的产物——胰酪胨[1]。胰酪胨，又称胰酪蛋白胨(Casein Tryptone)、胰酶消化酪蛋白胨(Pancreatic digest of casein)，是一种优质蛋白胨，含有丰富的氮源、氨基酸等，是微生物培养基关键原材料之一，能用于任何需要酪蛋白的胰酶或胰蛋白酶水解产物的配方之中，用于细菌的培养、分离、增殖、鉴定，以及无菌试验培养基、厌氧菌培养基等细菌生化特性试验用培养基的配置。特别是由于富含色氨酸可用于吲哚试验培养基和营养要求较高的生物培养基[2-3]。

本研究中采用当地所生产鲜牛奶经过等电点沉淀、洗涤、脱脂和冻干后生产的酪蛋白作为反应底物，经过胰蛋白酶水解后得到胰酪胨。分别研究pH值、反应时间、水解温度和酶与底物的浓度比对胰蛋白酶水解效率的影响，通过L9(34)正交表排列优化提取工艺参数，以期达到提高酪蛋白原料的利用率。同时亦获得成本较低、水解度高、氨基酸及其他各项理化性质达标的胰酪胨产品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛奶，胰蛋白酶，酪蛋白，胰酪胨标准品，BCA蛋白浓度测定试剂盒。

1.2 仪器与设备

TU1810型紫外可见分光光度仪，L-8800型氨基酸分析仪，PowerDry LL3000冻干机，AnkeTDL-S-A台式离心机，DK-s24恒温水浴箱，Z-2000原子吸收光谱仪。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的制备

(1)酪蛋白制备工艺流程

新鲜牛奶→等电点沉淀蛋白→离心洗涤(15 min，3 000 r/min)→抽滤洗涤→乙醚、乙醇脱脂→冻干

(2)酪蛋白制备工艺的参数确定[4-7]。为确定等电点法制备胰酪胨的最佳工艺条件，以100 mL经巴氏消毒后的鲜牛奶为原材料设计单因素试验进行制备。固定其他条件，分别考察提取温度(40，45，50，55，60 ℃)，pH值(4.3，4.5，4.7，4.9，5.1)对提取效果的影响。

(3)酪蛋白纯度采用双缩脲法测定。

1.3.2 胰酪胨的制备

1.3.2.1 胰酪胨制备工艺流程[8-11]

酪蛋白→加水后加热90℃保持30 min→调节pH，温度后加入胰蛋白酶→保持pH值，温度消化2 h→加入胰蛋白酶，保持pH值温度酶解1 h→加入胰蛋白酶，保持pH值温度酶解1 h→加入冰醋酸，同时加入活性炭，95℃以上搅拌15 min→过滤后干燥→胰酪胨

1.3.2.2 胰酪胨制备工艺要点[12-17]

为确定胰蛋白酶水解制备胰酪胨最佳工艺条件，根据胰蛋白酶水解工艺设计试验因素和水平，以水解度和氨基氮为考察指标，对水解温度、水解pH值、水解时间以及酶浓度和底物浓度比(E/S)，进行L9(34)正交实验，结果如表1所示。

表1 正交实验因素水平

1.3.3 理化性质检测方法[18-19]

为确定根据以上工艺条件制备出的胰酪胨完全符合市售胰酪胨产品理化指标要求，分别对其各项理化性质进行了检测。

(1)水解度(DH)的测定水解度采用pH-STAT法。

(2)氨基氮测定采用甲醛滴定法。

氨基氨质量分数＝滴定用标准碱毫升数×碱浓度×1.4／样品质量。

(3)总脂、水分、灰分和总氮的测定方法参照国家标 准 GB/T5009.5-2003，GB/T5009.10-2003，GB/T5009.3-2003，GB/T5009.4-2003中进行。

(4)氨基酸的测定方法采用国家标准GB/T18246-2000进行。

(5)胰酪胨所含蛋白质浓度检测采用BCA法测定。

(6)微量元素测定采用原子吸收法。

2 结果与分析

2.1 酪蛋白制备单因素试验

2.1.1 pH值对酪蛋白制备结果的影响

将100 mL经过巴氏消毒后的鲜牛奶预热至45℃时， 分别加入pH值为4.3，4.5，4.7，4.9和5.1的浓度为0.2 mol/L的醋酸——醋酸钠缓冲液中沉淀10 min，后经过排除乳清、水洗涤、脱脂和烘干得出酪蛋白，并检测酪蛋白产率和酪蛋白纯度。

由图1可以看出，在温度和提取时间固定的情况下，当pH值在4.7时，酪蛋白的产量最高，而不同pH值下提取的酪蛋白纯度相差不大。

图1 pH值对酪蛋白制备结果的影响

2.1.2 温度对酪蛋白制备结果的影响

将100 mL经过巴氏消毒后的鲜牛奶分别预热至40，45，50，55 ℃和60 ℃时， 分别加入pH值为4.7浓度为0.2 mol/L的醋酸——醋酸钠缓冲液中沉淀10 min，后经过排除乳清、水洗涤、脱脂和烘干得出酪蛋白，并检测酪蛋白产率和酪蛋白纯度。

图2 温度对酪蛋白制备结果的影响

由图2可以看出，在pH值和提取时间固定的情况下，当温度在40℃时，酪蛋白的产量最高，而不同pH值下提取的酪蛋白纯度相差不大。

2.2 胰蛋白酶水解制备胰酪胨工艺正交实验2.2.1 以水解度为指标进行正交实验[20-21]

以水解度为指标，进行L9(34)正交实验，结果如表2所示。

表2 胰蛋白酶水解正交试验设计与结果

由表2可得出，以水解度为指标，胰蛋白酶水解酪蛋白最佳条件为A2B2C3D1，即pH值为8.0，温度50℃，水解时间2.5h，E/S为0.24，此时水解度达44.4%。根据极差分析各因素的影响顺序为pH值＞酶解温度＞酶解时间＞E/S。

2.2.2 以氨基氮为指标进行正交实验

以水解度为指标，进行L9(34)正交实验，结果如表3所示。

表3 胰蛋白酶水解正交试验设计与结果

以氨基氮为指标，表示的是制备出的胰酪胨中所含的在微生物生长初期可以被快速利用的营养成分含量，培养基中氨基氮的含量直接决定了培养基中能被微生物吸收的氮源含量。由表3可以看出，处于A1B1C3D3，即pH值为8.0，温度40 ℃，水解时间1.5 h，E/S为0.32，此时氨基氮质量分数最高，达到4.5%。根据极差分析得出各因素的影响顺序为pH值＞酶解温度＞E/S＞酶解时间。

2.2.3 验证试验结果

以水解度为指标，得出制备胰酪胨的最佳条件为A2B2C3D1；以产物中氨基氮为指标，得出的制备最佳条件为A1B1C3D3。分别对工艺组合A2B2C3D1和A1B1C3D3进行三次平行试验，确定胰蛋白酶水解酪蛋白的最佳条件。在工艺组合A2B2C3D1中，平均水解度为43.68%，氨基氮为4.47%；而在工艺组合A1B1C3D3中，平均水解度为41.79%，氨基氮为4.52%。因此确定胰蛋白酶水解酪蛋白制备胰酪胨的最佳工艺条件为A2B2C3D1，即pH值为 8.0，温度50℃，水解时间2.5 h，E/S为0.24。

2.3 胰酪胨理化性质检测结果

参照国内蛋白胨质量标准和国外OXOID有关蛋白胨质量指标，将根据工艺条件A2B2C3D1制备出的胰酪胨进行理化指标的分析检测，结果如图3所示。

由图3可以看出，经过以上工艺流程制备出的胰酪胨与OXOID生产的标准品相比，各项理化指标接近。实验制备的胰酪胨经过检测，总氮量与酪蛋白纯度有关，实验测得数据和标准相近。因此在制备胰酪胨时，酪蛋白选择很重要。总磷、总脂、灰分的测定结果都小于标准品，其中总脂小于标准品是因为我们给样品采用了脱脂的实验操作，从而优化了胰酪胨的理化性质。

图3 各项理化性质与标准品比较结果

2.4 微量元素检测结果

为了确定制备出的胰酪胨符合微生物实验所需，实验测定了实验测定了胰酪胨的微量元素项目，并且提供国外OXOID标准品的详细参数，将制备的胰酪胨与标准品进行比较，结果如表4所示。

表4 微量元素分析 μg/g

通过表4可以看出，实验制备出的胰酪胨各项微量元素水平除Ca以外，都和标准品相差不大，尤其是重金属元素的水平还略低于标准品。Ca质量分数偏高是因为本地区的水质偏硬，所含Ca偏高。

2.4 氨基酸检测结果

氨基酸是蛋白胨中的主要成分之一，也是细胞生长过程中的重要营养成分。对所制备的胰酪胨进行氨基酸分析，结果如表5所示。由表5可以看出，该蛋白胨中的必需氨基酸种类齐全且质量分数高，因此自制胰酪胨产品具有较高的营养价值。

表5 氨基酸组分分析 %

3 讨 论

胰酪胨作为培养基关键原材料之一，其制备工艺以及制备出产品的质量直接影响微生物实验的结果。目前国内生产胰酪胨的厂家参差不齐，生产出的胰酪胨产品质量也无具体检测标准。培养基是医学卫生研究、医药工业生产、临床细菌检验、流行病学调查和生物制品制造等的重要基础。胰酪胨作为培养基关键原材料，其质量好坏直接决定了微生物检验和生物产品的产量和质量。目前国内对胰酪胨制备工艺的研究较少，尤其是对制备出的胰酪胨无一套完整的质量控制标准，各项理化性质检测手段也比较单一。

本研究中首先通过进行单因素试验确定了制备酪蛋白的最佳条件，即pH值为 4.7，温度40℃时酪蛋白产量最高。再通过分别以水解度和氨基氮为指标进行的L9(34)正交试验确定胰蛋白酶水解酪蛋白制备胰酪胨的最佳水解参数，即pH 8.0，温度55℃，时间2.5h，E/S为0.24，此时水解度达44.4%。按照此工艺条件制备出的胰酪胨通过各种检测方法，将其各项理化指标与国外同类型产品比较，差异不大，满足胰酪胨产品的规格要求，符合微生物实验所需。进行微量元素测定也证明实验制备出的胰酪胨各项微量元素水平与标准品接近，尤其是对微生物培养有害的重金属元素含量极低。对所制得的胰酪胨进行氨基酸分析，其氨基酸组成丰富，微生物生长所需的谷氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸等氨基酸质量分数较高，其他必需氨基酸种类齐全且丰富可为微生物的生长提供丰富的营养。本实验所优化出的胰酪胨制备工艺条件可为今后进行大规模高质量胰酪胨生产奠定了基础，有着良好的经济效益和较好的产业化前景。

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