脐血间充质干细胞治疗严重性系统性红斑狼疮的临床疗效初探

祁秋干 纪娜 史强 祁岩超

脐血间充质干细胞治疗严重性系统性红斑狼疮的临床疗效初探

祁秋干 纪娜 史强 祁岩超

目的探讨脐血间充质干细胞对严重性系统性红斑狼疮（SLE）的治疗效果。方法从健康产妇足月分娩的脐带血（UCB）中分离单个核细胞、培养制备间充质干细胞（MSCs）。MSCs培养到第三代时，取样UCB-MSCs，用流式细胞术进行性质鉴定显示：UCB-MSCs高表达CD29，CD90；不表达CD34和CD45。收集生长良好的第三代UCBMSCs。（5.0～6.0）×107个细胞加入100 ml含1﹪人血白蛋白的生理盐水中，静脉滴注；每天1次，6～10 d，一疗程；3～6个月后再用第2疗程。结果通过UCB-MSCs输注，使现有方法治疗无效的2例严重性系统性红斑狼疮患者的症状完全恢复。第1例SLE伴严重狼疮肾，狼疮脑10年，双下肢水肿，皮肤坏疽，溃疡深达骨面，剧痛难眠1年。经治医生动员她截肢保命。UCB-MSCs治疗后10 d，病情明显好转，双下肢水肿几乎全部消退。治疗6个月后，11处坏疽、溃疡的疮面10个疮面基本愈合。10个月后患者的坏疽，溃疡的疮面全部愈合，能自由活动，进入正常生活。第2例SLE伴狼疮肾，狼疮脑4年，一年来贫血严重，靠每周输血维持生命。UCB-MSCs治疗二个疗程后，咳嗽，呕吐症状明显好转，浮肿和双侧胸腔积液消失，各项检查指标基本正常，不需要输血治疗。恢复休学多年的学习生活。二者均随访8年，病情稳定，没发现复发症状。结论UCB-MSCs治疗2例严重性红斑狼疮，取得一定的疗效；这种新的技术可望成为治疗严重性系统性红斑狼疮的辅助疗法。

脐血干细胞移植；红斑狼疮，系统性

严重性系统性红斑狼疮（systemic lupus erythemotosus，SLE）是一种异质性疾病，是机体免疫系统功能失调后，对自身抗原产生免疫应答，造成自身组织器官病理损伤和功能障碍的一组疾病[1]。目前对SLE的治疗主要是采用非特异免疫抑制剂，如激素、环磷酰胺等。虽在一定程度上可减轻症状，但终不能彻底解决问题[2]。临床上对于那些“难治性SLE”更觉非常棘手，本研究采用脐血来源的间充质干细胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cells，UCB-MSCs）治疗2例严重性系统性红斑狼疮，均取得显著疗效，现报告如下。

材料与方法

一、材料

CO2恒温培养箱购自日本Hikama公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；L-DMEM购自Gibco公司；Ficoll-hypaque D = 1.077购自上海试剂二厂；人AB血清由广州市中心血站提供；CD分子单抗（CD29-PE、CD90-PE、CD34-FITC、CD45-FITC）购自美国Invitrogen公司。

二、方法

1.脐血采集：脐血是在患者知情同意的原则下，于正常足月妊娠健康供者分娩时获得，于胎儿娩出断脐消毒后，选择脐静脉穿刺，无菌采取血液30～50 ml入无菌肝素抗凝血袋中。患者在接受UCB-MSCs治疗前均获知情同意。

2.UCB-MSCs培养：所得脐血与PBS按1:1混匀，淋巴细胞分离液分离出脐血单个核细胞（2500 r/min，20 min），再用L-DMEM培养液离心洗涤2次，用L-DMEM（含5﹪AB血清）调整密度1.0×107/ml，接种到75 cm2培养瓶中，置于37℃、5﹪CO2培养箱内培养2～3 d，更换培养基，去除未贴壁的细胞，待贴壁细胞生长到90﹪融合时用0.25﹪胰蛋白酶消化传代，备用。

3.UCB-MSCs鉴定：收集第3代状态良好的UCB-MSCs，调细胞浓度1.0×106/ml，免疫组化及流式细胞术鉴定细胞表面标志物CD29、CD90、CD34和CD45。

4.UCB-MSCs输注：收集第3代以后状态良好的UCB-MSCs（5.0～6.0）×107个加入100 ml的含1﹪人血白蛋白的0.9﹪氯化钠溶液中，静脉输注，每天1次，6～10次为一个疗程。

三、病例

1.病例1：女，48岁，患严重SLE，狼疮脑、肾炎10年，伴下肢水肿，皮肤逐渐变黑，溃疡，有异味，坏疽及剧痛2年余，加重3个月。多方治疗效果不佳，且病情逐渐加重，权威医院拒绝收治，经治疗医生动员截肢保命。在极度的痛苦和绝望中，要求试用生物治疗。

2.病例2：男，18岁，患SLE，狼疮脑、狼疮肾炎伴双侧胸腔小量积液，全身浮肿，咳嗽、咳痰及呕吐等5年。经过积极对症支持治疗，效果不佳。而且贫血严重，靠每周输血一次维持生命。

结 果

一、UCB-MSCs培养及鉴定

UCB-MSCs常规培养约3～4 d可以达到90﹪以上融合并适于再次传代，细胞的排列呈典型的漩涡样，单个细胞呈典型纺锤型（图1）。经1:3比例传代之后，细胞经流式细胞术分析结果显示：UCB-MSCs均一性可达95﹪以上，UCBMSCs高表达CD29、CD90，不表达CD34、CD45（图2），符合MSCs的鉴定标准[3]。

图1 显微镜下观察常规培养的脐血来源间充质干细胞形态（× 100）

图2 UCB-MSCs表面抗原标志

二、病例1 UCB-MSCs治疗效果分析

自从2004年6月3日始用细胞治疗，UCBMSCs治疗过程中，停用其它常规治疗药物。UCB-MSCs治疗后第1天，其疼痛好转，食欲增加，睡眠良好。治疗后10 d，病情明显好转，双下肢水肿几乎全部消退。治疗6个月后，11处坏疽、溃疡的疮面10个疮面基本愈合，黑色痂皮已经脱落，呈现出了新鲜健康的皮肤组织。半年后进行第2疗程UCB-MSCs治疗，治疗后4个月，患者的坏疽，溃疡的疮面全部愈合（图3）。精神和体质明显好转，实验室检查结果基本恢复正常（表1）。现在患者已能自由活动，进入正常生活。随防近8年，病情稳定，没有发现复发症状。

图3 患者1 SLE伴下肢溃疡治疗效果

表1 2例SLE UCB-MSCs治疗前后实验室检查结果

三、病例2 UCB-MSCs治疗效果分析

2005年10月8日开始加用细胞治疗，UCBMSCs治疗过程中，其它常规治疗药物继续应用。第1个疗程后，咳嗽、咳痰及呕吐症状明显好转。3个月后，浮肿消失，双侧胸腔积液消失，不再需要输血治疗，继续进行第2个疗程UCB-MSCs治疗，并逐渐减少激素的用量；第2个疗程结束1月后停用激素。实验室检查，除蛋白尿在生物治疗前后无明显改变外，其它指标基本恢复正常（表1）。随访近8年，没有发现异常症状。

讨 论

近年研究表明，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有免疫原性弱，不诱导免疫排斥反应等特点。此外，它还具有类似“免疫豁免”的特性，可抑制同种异体免疫反应、降低移植物抗宿主病[4]。MSCs的双向免疫调控作用使其在组织工程、造血干细胞以及器官移植领域里有着广泛的应用前景[5-6]，因而受到越来越多的关注。MSCs的低免疫原性研究：MSCs属于未分化的干细胞，同种异体移植后无排斥反应或反应较弱。Lazarus等[7]将体外培养的不同浓度骨髓MSCs静脉注入患者体内，当细胞浓度高达5×107个/ml时，未发生明显的免疫排斥反应。MSCs免疫调节功能研究发现：MSCs不但具有多向分化潜能，还具有独特的免疫调节特性。体外MSCs能抑制T细胞在混合淋巴细胞培养或有丝分裂原刺激中的增殖反应。另有研究发现[8]，经体外扩增的MSCs输注小鼠体内，能延长异基因植入皮肤的存活时间，在受者体内不引起细胞和体液免疫应答，提示MSCs植入体内能发挥免疫抑制效应，在异基因干细胞移植中MSCs可以促进造血干细胞植入，可用于预防治疗移植物抗宿主病。

SLE是一种典型的自身免疫性疾病，目前临床上主要使用糖皮激素及其它广谱免疫抑制剂进行治疗，但其不良反应明显，并且效果有限[9]。最近有人提出自身免疫性疾病是造血干细胞异常导致的一组异常多克隆T、B淋巴细胞病，因此通过造血干细胞移植，破坏原来的异常免疫系统，恢复健康的免疫机制，有可能从根本上治愈自身免疫性疾病，并且在临床上也取得了一定的效果。但是由于某些严重SLE因多伴有脏器损伤，不能耐受强烈的清髓治疗，又因移植物抗宿主反应和移植相关死亡率较高等，难于广泛推广[2]。当前以DNA特异性B细胞为靶标的干预治疗即“DNA疫苗”策略已成为治疗SLE的热点[10]。研究发现自身反应性B细胞在抗原提呈及共刺激分子表达方面的缺陷，因此它能够逃避DNA疫苗诱导的细胞毒性T淋巴细胞的“识别或杀伤”，同时DNA疫苗的安全性和应用于人体后免疫效果明显减弱等问题也尚未完全解决[11]。目前，用UCB-MSCs治疗严重性SLE，已经取得了显著疗效[12]，可望为“难治性SLE”提供一个新的治疗方法，UCB-MSCs治疗SLE的机理目前尚不清楚，有待进一步研究。

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5 Macmillan ML,Blazar BR,DeFor TE,et al.Transplantation ofex-vivoculture-expanded parental haploidentical mesenchymal stemcells to promote engraftment in pediatric recipients of unrelated donor umbilical cord blood: Results of a phaseⅠ-Ⅱ clinical trial[J].Bone Marrow Transplant,2009,43(6):447-454.

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Efficacy and safety of umbilical cord blood mesenchymal stem cells for severe systemic lupus erythematosus: A pilot study

Qi Qiugan*,Ji Na,Shi Qiang,Qi Yanchao.*Cancer center,Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine of Southern Medical University,Guangzhou 510315,China

Objective Efficacy of cord blood mesenchymal stem cells for severe systemic lupus erythematosus.MethodsMononuclear cells were isolated from umbilical cord blood (UCB) of full-term delivery and cultured to prepare mesenchymal stem cells (MSCs).UCB-MSCs at third passage were analyzed with flow cytometry and used for transplantation.Tow patients with severe systemic lupus erythematosus which were resistant to all therapies were enrolled.(5.0-6.0)×107cells were mixed with 100 ml of saline containing 1﹪ human serum albumin for intravenous infusion.Each patient received 2 courses of treatment,separated by 3-6 months.Each course included 6-10 daily infusions.ResultsThe results showed UCB-MSCs highly expressed CD29 and CD90 but did not express CD34 and CD45. After UCB-MSCs infusion,both patients removed well.The first SLE patient had suffering from severe lupus nephritis and lupus brain for 10 years,with lower extremity edema,skin gangrene,and ulcers with exposed bone.She felt too painful to sleep for a year.The patient refused amputation to save her life.10 days after UCB-MSCs infusion,her conditions improved obviously,and lowerextremity edema almost relieved.6 months after treatment,10 of 11 gangrene and ulcer wounds healed.10 months after treatment,all wounds healed,and she could move freely.The second SLE patient has suffered lupus nephritis and lupus brain for 4 years.She has been received weekly blood transfusions for severe anemia for one year.After two courses of treatment with UCB-MSCs,the patient's symptoms such as cough and vomiting improved obviously,edema and bilateral pleural effusion relieved,and blood transfusions was stopped.The patient returned to school against after leaving school for years.During 8-year follow-up,their conditions were stable.Conclusion UCB-MSCs cells were effective to treat SLE.This new technique was expected to become an adjuvant therapy for SLE.

Cord blood mesenchymal stem cells；Lupus erythematosus,systemic

2013-12-18）

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.03.002

510315 广州，南方医科大学中西医结合医院肿瘤中心（祁秋干、纪娜）；广州友好医院生物中心（史强、祁岩超）

祁岩超，Email：ycqi@vip.tom.com

祁秋干,纪娜,史强,等.脐血间充质干细胞治疗严重性系统性红斑狼疮的临床疗效初探[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版,2014,4(3):153-157.