番石榴多酚成分分析及抑菌活性研究

黄和 林晓霞 邝高波 曹湛慧

摘 要 采用UPLC-MS/MS法对番石榴多酚中部分酚类物质进行了定性分析。以抑菌圈直径为评价指标，测定了番石榴多酚的抑菌活性，并以金黄色葡萄球菌为指示菌，对其抑菌稳定性进行了研究。结果表明：番石榴多酚中含有没食子酸、儿茶素、槲皮素、原儿茶酸、山奈素和绿原酸等酚类物质。番石榴多酚对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌、腐败希瓦氏菌和枯草芽孢杆菌具有较好的抑制效果，除了单增李斯特菌和腐败希瓦氏菌的MIC低于5 mg/mL外，其余均低于2.5 mg/mL。番石榴多酚在pH4～5范围内处理后抑菌活性最强，其抑菌活性对温度、紫外照射具有稳定性，低盐度会促进其抑菌活性。

关键词 番石榴多酚；酚类物质分析；抑菌活性

中图分类号 TS255.1 文献标识码 A

番石榴（Psidium guajava L.）属于桃金娘科番石榴属，嗜热畏寒，为亚热带水果，在我国广东、广西、福建均有种植，其味清香可口，含有丰富的营养物质[1]。微生物是引起食物腐败的一个重要因素，不仅降低食物感官品质、营养价值，产生的毒素更会危害人体健康。在食品工业领域，防止食物腐败的方法有冷藏、杀菌、密封包装、添加防腐剂等，以延长产品的货架期[2-4]。防腐剂分为化学合成防腐剂和天然活性防腐剂，合成防腐剂价格低廉、效果显著，但具有潜在的安全问题，因此天然防腐剂的研究受到越来越广泛的重视。植物多酚类物质具有抑菌活性，据报道苹果多酚对细菌具有较强的抑制作用[5]，葡萄多酚对金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、沙门氏菌、大肠埃希氏杆菌等具有抑制作用[6]，而番石榴果肉多酚的抑菌活性在国内外并无系统的研究。本研究采用牛津杯法测定了番石榴多酚的抑菌活性，并同时测定了其抑菌稳定性，旨为天然防腐剂提供另一种可行性选择。目前关于番石榴多酚的成分鉴定及定量研究尚属空白，而且多酚类物质种类繁多，有待进一步对其化学成分进行鉴定。本文运用HPLC和UPLC-MS/MS测定了番石榴多酚中的部分酚类物质，可为其进一步化学成分鉴定提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

番石榴购于湛江沃尔玛超市，产地湛江；大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli，G-），金黄色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus，G+），副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，G-），单增李斯特菌（Listeria spp，G+），铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，G-），腐败希瓦氏菌（Hewanella putrefacens，G-），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，G+）取自广东海洋大学食品科技学院微生物实验室；营养琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；山梨酸钾（化学纯）出自中国医药上海化学试剂公司；色谱纯甲醇出自天津市协和昊鹏色谱科技有限公司；乙酸为广东光华化学厂有限公司；槲皮素，没食子酸，儿茶素，绿原酸，阿魏酸，咖啡酸，原儿茶酸来自中国食品药品检定研究院；山奈素，根皮苷购于北京金宝在线科技有限公司，试剂都为色谱纯级。

超净工作台（洁净等级100级）出自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SPX-250-Z型生化培养箱出自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BL-620S电子天平出自日本Shimadzu公司；YX-280 型手提式压力蒸汽消毒器出自江阴滨江医疗设备厂；TSQ Quantum Access液质联用仪（ESI）出自美国Thermo公司；色谱柱为UPLC ACQUITY BEH，50 mm×2.1 mm，1.7 μm；

1.2 方法

1.2.1 番石榴多酚组分的分离及分析 番石榴多酚的制备：微波辅助法提取番石榴多酚[7]，粗提物旋转蒸发浓缩备用。采用NKA-9大孔吸附树脂纯化番石榴多酚[8]，然后用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶进一步分离[9]，得到4个不同组分：GP1、GP2、GP3和GP4。

UPLC-MS测定番石榴多酚组分：将Sephadex LH-20葡聚糖凝胶分离番石榴多酚后得到的4个组分用色谱纯甲醇定容至1 μg/mL，槲皮素、没食子酸、儿茶素等标品用少量色谱纯甲醇湿润后，配制成1 mg/mL母液，取各自母液1 mL定容至1 μg/mL，得到标准液，4 ℃保存备用。采用UPLC-MS对番石榴多酚分离组分GP1、GP2、GP3和GP4中部分简单酚类成分进行测定，条件如下：

流动相：乙腈（A）/0.1甲酸水溶液（V ∶ V）；梯度洗脱程序为：0～1 min，20% A；1～3 min，20%～50% A；3～4 min，90% A保持1 min。流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；

进样量：10 μL；离子源：ESI，负离子模式；毛细管电压：4.0 kV；离子源温度：110 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：800 L/h；锥孔反吹气流量：50 L/h；锥孔电压：40 V；扫描方式：多反应监测（MRM）。

1.2.2 番石榴多酚抑菌活性测定 菌悬液的制备：将供试菌株划线于无菌营养琼脂斜面后于37 ℃下培养24～36 h，在无菌条件下向已活化好的供试菌株琼脂斜面中加入10 mL无菌生理盐水，轻轻刮松菌苔，涡旋振荡器振荡混匀，用无菌生理盐水进行10倍稀释，制成初始稀释菌悬液，浓度为106～107 cfu/mL，备用。

抑菌活性定性试验：称取6 g素琼脂于300 mL蒸馏水中加热溶解，分装于3个250 mL三角瓶中高压灭菌，冷却至50 ℃左右时，在超净工作台上倒入无菌培养皿中，每个培养皿约5 mL，水平放置，让其均匀铺满培养皿底部，凝固后在平板上均匀摆放4个无菌牛津杯（外径8 mm，内径6 mm）备用。

取营养琼脂33 g于1 L水中加热完全溶解，分装在100 mL三角瓶中灭菌，待培养基冷却至50 ℃左右时，取2 mL各菌悬液分别加入培养基中摇匀，趁热将没凝固的含菌营养琼脂培养基倾入摆放了牛津杯的素琼脂平板上层，每个平板约10 mL，水平放置均匀铺满平板，待凝固后取下牛津杯，向含不同测试菌平板的牛津杯孔中分别加入前面制备好的80 μL 10、5、2 mg/mL的番石榴多酚溶液，以无菌水为对照，细菌于37 ℃左右培养24 h，真菌培养48 h后观察有无抑菌圈，游标卡尺测定抑菌圈大小（测定抑菌透明圈的直径），平行试验3次，以无菌水溶液为空白对照。

最低抑菌浓度（MIC）的测定：采用二倍稀释法将番石榴多酚溶液稀释成浓度50、25、12.5、6.25、3.125 mg/ml的梯度溶液，灭菌后分别取1 mL加入9 mL含有各测试菌的融化营养琼脂中混匀，使其浓度为5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 mg/mL，倒平板在37 ℃左右培养24 h，观察菌体生长情况，以确定作为最低抑菌浓度，以山梨酸钾溶液作为阳性对照，无菌水测试菌作为空白对照，平行3次。

pH值对番石榴多酚的抑菌效果：配制pH分别为2～3、3～4、4～5、5～6、6～7、7～8、8～9的5 mg/mL的番石榴多酚溶液，处理适当时间后，将pH重新调回至中性，以金黄色葡萄球菌为指示菌，按前述抑菌活性定性试验方法测定不同pH处理番石榴多酚后对抑菌效果影响，平行试验3次。

番石榴多酚抑菌活性的热稳定性试验：将5 mg/mL的番石榴多酚溶液分别于60、70、80、90 ℃水浴以及于121 ℃加热20 min，以金黄色葡萄球菌为指示菌，按前述抑菌活性定性试验方法分别测定不同温度处理后的番石榴多酚的抑菌效果，以测定番石榴多酚抑菌活性的热稳定性，平行试验3次。

盐对番石榴多酚抑菌效果的影响：5 mg/mL的番石榴多酚溶液配制成分别含有0.1%、0.3%、0.6%、0.9%氯化钠的待试液，以含同等浓度氯化钠的无菌水作为空白对照组，金黄色葡萄球菌为指示菌，按前述抑菌活性定性试验方法测定无机盐对抑菌效果的影响。

紫外辐射对番石榴多酚抑菌活性的影响：将5 mg/mL番石榴多酚溶液放置于超净工作台上紫外照射0、10、20、30、40、50、60 min，以无菌水溶液为对照，金黄色葡萄球菌为指示菌，按前述抑菌活性定性试验方法测定紫外照射对番石榴多酚抑菌稳定性的影响。

2 结果与分析

2.1 UPLC-MS测定番石榴多酚

标准品UPLC-MS/MS色谱图和质谱参数分别见图1和表1。根据上述UPLC-MS/MS条件以及离子碎片信息，对番石榴多酚进行定性测定，结果见表2。番石榴多酚经葡聚糖凝胶纯化得到的4个组分中均含有山奈素，儿茶素，没食子酸，原儿茶酸，GP1中没食子酸含量最高（69.4 mg/kg），其次是儿茶素（23.99 mg/kg），山奈素含量最低，绿原酸为其特有成分；GP2中没食子酸含量为529.74 mg/kg，在4个组分中含量最高；GP3中儿茶素（2 191.49 mg/kg）含量最多，均高于其它组分，但山奈素含量低于另外3个组分（0.25 mg/kg）；槲皮素是GP4中特有成分，含量为32.38 mg/kg。

2.2 抑菌活性定性试验

番石榴多酚抑菌效果的定性试验结果见表3。根据表中各成分对供试菌种的抑菌圈大小，可以看出番石榴多酚具有一定的抑菌活性，具有较为广泛的抑菌谱。在试验浓度内，对受试菌种大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、腐败希瓦氏菌、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌都具有抑制活性，对副溶血弧菌没有抑制活性。番石榴多酚的浓度和抑菌圈大小具有剂量关系，浓度越大抑制效果越明显，当浓度降至2 mg/mL时，只对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌以及枯草芽孢杆菌具有抑制作用，空白对照组没有观察到抑菌圈。

2.3 最低抑菌浓度（MIC）的测定

番石榴多酚对各供试菌的最低抑菌浓度见表4。铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的MIC低于1.25 mg/mL，大肠杆菌的MIC低于2.5 mg/mL，单增李斯特菌和腐败希瓦氏菌的MIC低于5 mg/mL，番石榴多酚对单增李斯特菌和腐败希瓦氏菌的抑制活性低于其他几种供试菌。防腐剂山梨酸钾对单增李斯特菌的MIC低于5 mg/mL，其余的都低于2.5 mg/mL，番石榴多酚对供试菌的抑菌活性和对照品防腐剂的抑菌活性相当，甚至略优于山梨酸钾，说明番石榴多酚具有成为新型天然活性防腐剂的潜力。

2.4 不同pH值对番石榴多酚的抑菌效果的影响

以金黄色葡萄球菌为指示菌，不同pH处理后的番石榴多酚的抑菌效果如图2。酸性条件处理后番石榴多酚的抑菌效果比在碱性条件处理后强，在pH4～5范围内处理后抑菌活性最高，pH超过8以后，抑菌效果急速下降。分析这是因为多酚类物质自然情况下属于酸性物质，在碱性环境中结构会遭到破坏而引起抑菌效果的减弱，总体上看番石榴多酚在较广的pH范围内抑菌效果较好。

2.5 番石榴多酚抑菌活性的热稳定性试验

番石榴多酚抑菌活性的热稳定性效果见图3。在60～121 ℃范围内，抑菌圈直径波动很小（p>0.05），其抑菌热稳定性较好，适合添加在需热处理的食品中作为天然防腐剂。

2.6 盐浓度对番石榴多酚抑菌效果的影响

低浓度盐对番石榴多酚抑菌效果影响见图4。盐对番石榴多酚的抑菌效果具有一定的促进作用，在试验浓度范围内，浓度越高，抑菌圈直径越大，而相同盐浓度的各对照组均没有观察到明显的抑菌圈，说明抑菌活性的增加不太可能是渗透压增高而引起的，具体原因有待进一步研究。

2.7 紫外辐射对番石榴多酚抑菌活性的影响

紫外辐射对番石榴多酚抑菌活性影响见图5。从图5可以得出，在试验条件内番石榴多酚对金黄色葡萄球菌的抑制活性不受紫外照射的影响（p>0.05），这个条件下番石榴多酚结构稳定，这可能是因为番石榴多酚本身具有苯环结构，在紫外区具有强吸收峰，结构的稳定不至于受影响，从而保证了抑菌活性的稳定[10]。

3 讨论与结论

通过HPLC和UPLC-MS/MS对番石榴多酚中酚类成分进行定性和定量分析，发现其中含有没食子酸、槲皮素、山奈素、儿茶素、原儿茶酸和绿原酸等酚类物质。其另外成分需继续鉴定。

番石榴多酚对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌、腐败希瓦氏菌和枯草芽孢杆菌具有较好的抑制效果，除了单增李斯特菌和腐败希瓦氏菌的MIC低于5 mg/mL外，其余均低于2.5 mg/mL。番石榴多酚在pH为4～5范围内的抑菌活性最强，其抑菌活性对温度、紫外照射具有稳定性，低盐度会促进其抑菌活性。

植物多酚的抑菌机理目前并不明确，大量研究表明可能是通过以下途径来达到抑菌效果[11]：植物多酚与细菌蛋白质结合；抑制细菌酶的合成；结合微生物生长必需物，造成微生物死亡；多酚的邻苯二酚结构赋予其良好的金属离子结合能力，与铁离子结合而破坏微生物新陈代谢。与苹果多酚、葡萄多酚等其他植物多酚的抑菌活性[5-6]相比，番石榴多酚也具有较好的抑菌活性，可作为天然防腐剂使用，并且原料价格便宜，来源容易。但是作为一种复合物，其具体是番石榴多酚中的哪几种成分具有抑菌活性，以及具体抑菌机理有待进一步研究。

参考文献

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责任编辑：叶庆亮