油樟叶总黄酮和总多糖的抑菌活性

杜永华　敖光辉　魏琴等

摘要：采用纸片扩散法、二倍稀释法、平板菌落计数法测定了油樟叶总黄酮、总多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌3种细菌的抑菌活性。结果表明，油樟叶总黄酮、总多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑制活性均表现出一定的浓度依赖性，其MIC分别为16.000、8.000、16.000 mg/mL和16.000、16.000、32.000 mg/mL，MBC分别为16.000、16.000、32.000 mg/mL和16.000、32.000、64.000 mg/mL。油樟叶总黄酮和总多糖均明显干扰受试菌的正常生长过程。

关键词：油樟；黄酮；多糖；抑菌活性

中图分类号： R285.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0408-03

收稿日期：2014-11-24

基金项目：四川省基础研究项目（编号：2011JY0050）；四川省青年科技创新研究团队培育计划（编号：2011JTD0035）；四川省省属高校科研创新团队建设计划（编号：14TD0031）。

作者简介：杜永华（1978—），男，四川遂宁人，硕士，讲师，主要从事天然产物及其生物活性研究。E-mail：yonghuad@163.com。

通信作者：魏琴，博士，教授，主要从事植物资源开发利用研究。E-mail：weiqin2011-67@163.com 。油樟[Cinnamomum longepaniculatum （Gamble） N. Chao]属樟科樟属植物，是我国特有树种，主产于四川省宜宾市，其枝叶均富含挥发油，是食品、香料、医药、日用、化工产品的重要原料来源[1-2]。油樟与药用植物香樟[Cinnamomum camphora （Linn.） Presl]为同属植物，均具有多种药理活性。研究表明，油樟叶挥发油具有较强的抗微生物活性[3-6]，提取挥发油后的油樟叶残渣提取物具有抗微生物作用[7-10]。目前关于油樟叶提取挥发油后残渣的化学成分及其生物活性研究较少，关于油樟叶中总黄酮的抗菌活性研究未见报道。本试验对油樟叶提取挥发油后残渣中的总黄酮进行抗菌活性研究，旨在为油樟资源的开发利用提供依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

油樟叶采自宜宾市翠屏区邱场乡油樟种植基地；芸香苷标准品（含量≥92.5%，批号100080—200707，中国药品生物制品检定所）；D（+）-无水葡萄糖标准品（含量≥98%，贵州迪大科技有限责任公司）；青霉素G钾盐（1 440 U/mg，Sigma 公司）；硫酸链霉素（720 U/mg，Sigma公司）；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2菌种与培养基

大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室提供。营养琼脂（NA）液体培养基：0.5 g牛肉膏，1 g蛋白胨，0.5 g氯化钠，加热搅拌溶解于100 mL蒸馏水中，调节pH值至7.3±0.1，121 ℃下高压灭菌20 min，该培养基中加入1.5 g琼脂即为固体培养基。

1.3主要仪器

AR2130电子天平（赛多利斯公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；LG-5A真空冷冻干燥机（上海离心机机械研究所有限公司）。

1.4方法

1.4.1油樟叶总黄酮的制备将新鲜油樟叶自然晾干，用水蒸气蒸馏法除去挥发油，残渣（60±1） ℃烘干，粉碎，取过60～80目筛油樟叶粉末50 g，按料液比1 g ∶21 mL加入体积分数为50%的乙醇溶液，室温浸泡36 min，88 ℃水浴回流提取105 min；过滤，滤液于60 ℃减压浓缩至浸膏，加100 mL 蒸馏水溶解，加入适量石油醚萃取至石油醚层无色，取水层浓缩至50 mL，加入乙醇溶液调节乙醇终浓度至80%，4 ℃醇沉过夜（除去多糖、蛋白、鞣质等杂质）；过滤，滤液减压浓缩至膏稠状，真空冷冻干燥，得总黄酮粗品。采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色体系[11]测定油樟叶总黄酮含量。将油樟总黄酮粗品用10%乙醇溶液配制成浓度为64.00 mg/mL的储备液，用直径为0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后备用。

1.4.2油樟叶总多糖的制备取过60～80目筛除去挥发油的油樟叶干燥粉末50 g，按料液比1 g ∶20 mL加入水，100 ℃水浴回流提取3 h，过滤，滤液浓缩至1/5体积，加入乙醇溶液调节乙醇终浓度至80%，4 ℃醇沉过夜，12 000 r/min冷冻离心5 min，取沉淀真空冷冻干燥，得总多糖粗品。采用苯酚-硫酸法测定油樟叶总多糖含量。将油樟总多糖粗品用无菌水配制成浓度为64.00 mg/mL的储备液，用直径为0.22 μm 的微孔滤膜过滤除菌后备用。

1.4.3菌株活化及菌悬液制备无菌条件下将保藏菌种接入NA平板培养基，37 ℃恒温培养18～24 h；挑去单个特征菌落接种于5 mL灭菌NA液体培养基中，37 ℃恒温培养18～24 h；取0.5 mL菌悬液加入4.5 mL NA液体培养基中，用血细胞计数板计数，用NA液体培养基稀释菌悬液使其浓度为105～106 CFU/mL[7]，备用。

1.4.4抑菌效果的测定采用纸片琼脂扩散法[12]测定测试物的抑菌效果。将定性滤纸制成直径为6 mm的圆纸片，置于洁净干燥的试管内，121 ℃湿热灭菌20 min后烘干。测定100片滤纸片吸水量，根据吸水量在无菌条件下滴加不同浓度的药液，使油樟总黄酮粗品、总多糖粗品的纸片含药量均分别为512.00、256.00、170.67 μg/片，阳性对照纸片含药量为青霉素G钾盐10 U/片、硫酸链霉素10 μg/片，37 ℃干燥后密闭低温保存备用。取0.5 mL各菌悬液分别涂布于NA平板培养基上，每个平皿放4张含药滤纸，分别为油樟叶总黄酮、总多糖的3个浓度梯度及1个阳性对照，每个浓度3个平行。以放溶剂纸片的加菌培养基为溶剂对照，不加菌培养基为无菌对照。37 ℃恒温培养箱培养24 h，观察是否有抑菌圈，若有，则用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.4.5最小抑菌浓度（MIC）的测定采用二倍稀释法[7]将油樟叶总黄酮粗品、总多糖粗品用相应无菌溶剂稀释成64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL的系列溶液，分别取0.5 mL总黄酮、总多糖溶液至4 mL NA液体培养基中，加入0.5 mL菌悬液，充分摇匀，37 ℃、 115 r/min摇床培养24 h，每个浓度重复3次，同时设无菌对照组（不含菌的NA液体培养基）、溶剂对照组（加相应溶剂的含菌NA液体培养基）。用肉眼观察法观察每支试管中细菌的生长情况，以完全不长菌的浓度为最小抑菌浓度（MIC）。

1.4.6最小杀菌浓度（MBC）的测定在MIC基础上，从未见细菌生长的试管中取出0.5 mL培养物加入装有4.5 mL NA液体培养基中，37 ℃培养24 h，取0.1 mL培养液用涂布平板法计数，以菌落数少于5个的最低浓度为油樟叶总黄酮、总多糖对该菌的最小杀菌浓度（MBC）[7]。

1.4.7抑菌曲线的测定参考陶翠等的方法[4]，用NA液体培养基将油樟叶总黄酮粗品、总多糖粗品配制成MIC浓度，分别接种3种细菌，使其终浓度为105 CFU/mL，充分混匀后于37 ℃培养，分别于0、2、4、8、12、24、36、48 h吸取1.0 mL菌液，按10倍比例稀释，加入19 mL NA培养基混匀后制成平板，37 ℃培养24 h后计算菌落，根据稀释浓度计算1 mL活菌数，以菌落数的对数为因变量，以培养时间为自变量在直角坐标系中作图，即得油樟叶总黄酮或总多糖对细菌的时间抑菌曲线，同时设含相应菌的培养基空白对照。

2结果与分析

2.1油樟叶总黄酮、总多糖含量测定

50 g提取挥发油后的油樟叶渣经醇提法提取总黄酮，冷冻干燥获得油樟叶总黄酮粗品4.60 g，经比色法测得油樟叶总黄酮粗品中总黄酮含量为381.83 mg/g，油樟叶总黄酮提取率为3.51%；获得油樟叶总多糖粗品2.65 g，经苯酚-硫酸法测定总多糖粗品中总多糖含量为371.22 mg/g，总多糖提取率为1.97%。

2.2油樟叶总黄酮、总多糖的抑菌效果

由表1可知，油樟叶总黄酮、总多糖粗品对3株细菌均具有一定的抑菌作用，其抑菌圈直径随着纸片含药量的增加而增加，表现出一定的剂量依耐性，但均低于阳性对照组。油樟总黄酮粗品对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑菌圈基本上大于油樟总多糖粗品，但油樟总多糖粗品对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大于油樟总黄酮粗品。阳性药物组对相应细菌的抑菌圈均达到美国抗微生物药物敏感性试验执行标准（CLSI）的敏感水平，溶剂对照组、无菌对照组均无异常现象。512.0 μg/片油樟总黄酮粗品对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径是10 U/片青霉素G钾盐的30.3%，对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径是青霉素G钾盐的50.0%。

2.3油樟叶总黄酮、总多糖的最小抑菌浓度

由表2可知，无菌对照组无菌生长，溶剂对照组有菌生长。油樟叶总黄酮和总多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为16.000、8.000、16.000 mg/mL和16.000、16.000、32.000 mg/mL。

2.4油樟叶总黄酮、总多糖的最小杀菌浓度

由表3可知，无菌对照组无菌生长，溶剂对照组有菌生长。油樟叶总黄酮、总多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌作用24 h后的最小杀菌浓度分别为16.000、16.000、32.000 mg/mL和16.000、32.000、64.000 mg/mL。

2.5油樟叶总黄酮、总多糖抑菌曲线

由图1至图3可知，3种细菌在溶剂对照中均能正常生长，有较明显的调整期、对数期、稳定期、衰亡期。油樟叶总黄酮、总多糖在1倍MIC下，金黄色葡萄球菌均直接进入了衰亡期，表现出明显的杀菌作用；1倍MIC总黄酮使枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的调整期延长，无明显对数期、稳定期，24 h内缓慢生长，但活菌数量较溶剂对照组低，随即进入衰亡期；

3结论与讨论

本试验结果表明，油樟叶总黄酮、总多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌均具有一定的抑菌活性，其抑菌效果随着总黄酮、总多糖浓度的增加而增强。油樟总黄酮对金黄色葡萄球菌的MIC、MBC与总多糖相同，说明总黄酮、总多糖对金黄色葡萄球菌的抑制作用相当。总黄酮对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的MIC、MBC均低于总多糖，表明总黄酮对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑制作用强于总多糖。这一现象与光石韦总黄酮和多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的作用趋势相似[12]。油樟叶总黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌活性（MIC均为16.000 mg/mL）强于油樟叶乙醇提取物 （MIC均为31.25 mg/mL）[7]。与油樟同属植物香樟叶在除去挥发油后的乙醇提取物主要成分为黄酮类化合物，其黄酮类化合物提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌均有较强抗菌活性[13-14]。由此可知，油樟叶总黄酮可能是油樟叶乙醇提取物中主要的抑菌成分。油樟叶总多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性（MIC分别为16.000、32.000 mg/mL）弱于香樟叶水提取物（MIC均为15.63 mg/mL）[15]。孙崇鲁研究表明，香樟叶水提取物含有较多的多糖成分[16]。但油樟叶总多糖的抑菌活性是否弱于香樟叶总多糖还有待进一步研究。

参考文献：

[1]吴征镒，孙航，周浙昆，等. 中国植物区系中的特有性及其起源和分化[J]. 云南植物研究，2005，27（6）：577-604.

[2]罗中杰，李维一，魏琴，等. 宜宾油樟的现状及未来[J]. 四川师范大学学报：自然科学版，2001，24（3）：317-319.

[3]魏琴，周宇科，周黎军，等. 油樟油抑制细菌生长的活性试验[J]. 热带农业科学，2009，29（1）：5-7.

[4]陶翠，魏琴，殷中琼，等. 油樟叶挥发油对三种真菌的抗菌效果[J]. 中国兽医科学，2011，41（1）：89-93.

[5]黄彤，游玲，杜永华，等. 油樟油副产物对细菌性皮肤致病菌的抑制作用[J]. 四川农业大学学报，2014，32（1）：53-58.

[6]张萍，王平，石超峰，等. 油樟油主成分对几种常见病原菌的抑菌活性研究[J]. 四川农业大学学报，2013，31（4）：393-397.

[7]张超，魏琴，杜永华，等. 脱油油樟叶提取物的体外抑菌活性研究[J]. 广西植物，2011，31（5）：690-694.

[8]曹玫，陶翠，房俊，等. 油樟叶油枯提取物抗病原真菌活性研究[J]. 时珍国医国药，2012，23（11）：2792-2793.

[9]魏琴，殷中琼，杜永华，等. 油樟叶乙醇提取物抗炎活性的研究[J]. 中国兽医科学，2011，41（8）：859-864.

[10]魏琴，殷中琼，杜永华，等. 油樟叶乙酸乙酯萃取物镇痛抗炎作用的研究[J]. 中国兽医杂志，2013，49（5）：76-78.

[11]国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部[M]. 北京：化学工业出版社，2005：333.

[12]钟霞军，蓝芳，朱丹青，等. 光石韦抑菌活性的研究[J]. 时珍国医国药，2014，25（3）：574-575.

[13]孙崇鲁，黄克瀛，陈丛瑾，等. 香樟叶中黄酮类化合物的提取[J]. 应用化工，2006，35（2）：142-143.

[14]戴群，朱晓新，翁德宝. 香樟叶黄酮类化合物的提取及抑菌作用的研究[J]. 江苏教育学院学报：自然科学版，2008，25（3）：30-34.

[15]邓海英，于志君，张垚，等. 樟树叶提取物对几种消化道感染细菌的抑制作用研究[J]. 时珍国医国药，2011，22（7）：1781-1782.

[16]孙崇鲁. 香樟叶中多糖的提取及含量测定[J]. 应用化工，2011，40（8）：1434-1436.王栋梁，王娜，王丹蕾，等. 冬瓜皮成分及抗氧化活性成分分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：411-414.