多花水仙WRKY转录因子的克隆与序列分析

李欢 何炎森 李科 申艳红 吴用 陈晓静

摘 要 以‘黄花水仙2号和‘金盏银台为材料，根据课题组已克隆出的多花水仙转录因子WRKY基因片段设计特异引物，通过RACE技术分别从2个水仙品种中克隆出2个不同的WRKY基因，命名为NtWRKY40a和NtWRKY40b，开放阅读框（ORF）长度分别为945和951个碱基。序列分析结果表明，两序列均含有WRKYGQK保守结构域；‘黄花水仙2号与‘金盏银台、拟南芥、葡萄、青蒿、小麦和粳稻的相似系数分别为：97.27%、45%、43%、47%、41%和43%。Real-time PCR分析结果表明：WRKY基因在花瓣和副冠开花过程中的表达量发生变化，说明其可能参与多花水仙花朵的衰老过程。

关键词 中国水仙；WRKY转录因子；基因克隆；序列分析

中图分类号 S682.21 文献标识码 A

转录因子（transcription factor，TF），是位于细胞核内能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的蛋白质分子，其主要功能是激活或抑制基因的转录效应[1]。近年来，已相继从高等植物中分离出一系列应对干旱、高盐、低温、激素、病原反应及发育等相关基因表达的转录因子[2]。随着人们对转录因子结构和功能的深入了解，人为的控制植物特定基因的表达来改良作物品质，已成为一种快捷、高效而颇具潜力的育种途径。

WRKY作为植物体内的转录因子，其蛋白质N-端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列，C-端含有1个锌指型结构（Cys2His2或Cys2His/Cys），通过与靶基因启动子区域W-box（C/TTGACT/C）的特异结合而调控基因的表达[3]。研究结果表明，WRKY转录因子家族参与调控植物的生长发育和各种生理进程，在一定程度上，可通过激活或抑制其他TF和调节WRKY基因的前馈和反馈循环，直接作用下游靶基因，其对水杨酸、机械损伤和病原防御等许多因子的应答具有迅速、短暂的特点[4-5]。Ishiguro等[6]最早从甘薯中发现WRKY因子，之后在野燕麦[7]、欧芹[8]，拟南芥[9]等植物中也相继克隆和分离出WRKY。但尚未见到有关水仙WRKY转录因子基因的报道。为此，本研究以多花水仙为材料，根据多花水仙花瓣抑制消减杂交cDNA文库[10]获得的WRKY转录因子EST序列设计特异引物，利用RACE和RT-PCR技术克隆水仙WRKY基因全长，并对其进行生物信息学分析，为后续WRKY基因的功能研究及从转录水平上改善水仙的观赏价值奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用的多花水仙主要有两种类型：双色花水仙‘金盏银台取自漳州水仙花生产地；‘黄花水仙2号，由福建农林大学园艺遗传育种研究所提供。‘金盏银台副冠浅黄色，花瓣白色；‘黄花水仙2号花瓣和副冠均为黄色，花瓣颜色较副冠深。取花蕾期、始花期、盛花期和衰败期花朵，用镊子小心除去花丝、花药和柱头，液氮速冻于-80 ℃下贮藏备用。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取和反转录 使用离心柱型多糖多酚RNA提取试剂盒（购自北京百泰克生物限公司）分别提取‘金盏银台和‘黄花水仙2号花蕾期、始花期、盛花期和衰败期的花瓣与副冠的总RNA。用Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（购自Fermenta）合成的cDNA用于3′-RACE。用Super SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（购自Contech公司）合成的cDNA用于5′-RACE。用SYBRPrimeScriptRT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂盒（购自TaKaRa）合成的cDNA用于qRT-PCR。具体的RT反应参照Fermenta、Contech和TaKaRa公司的使用说明书。

1.2.2 PCR引物的设计与合成 根据课题组已经获得的WRKY转录因子片段和多花水仙的EST序列设计特异引物（见表1）。引物合成和基因测序均委托北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.2.3 ‘黄花水仙2号WRKY基因cDNA全长克隆

以‘黄花水仙2号的cDNA为模板分别进行5′-RACE和3′-RACE的扩增。反应体系均采用25 μL和35 cycle、退火时间均为90 s。3′端序列的克隆，第一轮PCR反应上下游引物分别为：WRKY 3′-1和AUAP。第一轮PCR反应产物稀释10倍作为模板，以WRKY 3′-2和AUAP为引物进行第二轮扩增。5′端序列的克隆，以WRKY 5′-1和UPM为引物进行第一轮扩增，将第一轮产物稀释10倍为模板，以WRKY 5′-2和UPM为引物进行第二轮扩增。

1.2.4 ‘黄花水仙2号和‘金盏银台ORF的获得

测序结果用Sequencher4.2除去18-T和通用引物序列，拼接WRKY基因的5′端、3′端，并于NCBI上预测其保守区。根据ORF两端序列设计特异引物，以WRKY-F和WRKY-R分别为上下游引物扩增2种水仙的编码区。凝胶电泳后回收目的片段，连接至PGEM载体并转化DH5α（Escherichia coli.），菌液鉴定后测序。

1.2.5 序列拼接及生物信息学分析 引物设计、序列拼接及分析使用DNAMAN、Primer5.0和Sequencher4.2。氨基酸多重序列比对和CDD功能区域分析使用NCBI中的BLASTX（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；氨基酸理化分析使用ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam）；构建系统进化树使用MEGA5.05中的邻近相法neighbor-joining tree；氨基酸序列信号肽预测使用SignalP 4.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）；氨基酸序列跨膜预测使用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；亚细胞定位使用softberry（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml）。

1.2.6 ‘黄花水仙2号和‘金盏银台qRT-PCR的检测与分析 将2种水仙的cDNA模板稀释5倍，以actin（genebank acession： JN204912.1）为内参基因，WRKY-U和WRKY-D为上下游引物来检测WRKY基因在2种水仙不同时期的转录水平。使用25 μL qRT-PCR反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 9.5 μL，每个样品设置3次重复。qRT-PCR程序为：Stage1： 预变性，94 ℃，3 min；Stage2： PCR反应，94 ℃变性15s；56 ℃退火35 s，循环40 cycle。Stage3： Dissociation。反应结束后，分析Bio-Rad CFX96中的熔解曲线和扩增曲线，导出数据。从不同时期的相关基因扩增曲线中得到Ct值，通过actin的校正最终得到目的基因的相对表达量。

1.3 数据处理

采用2-△△ct（Livak）法，并用Excel和geNorm程序处理和分析荧光数据。

2 结果与分析

2.1 多花水仙WRKY基因cDNA全长克隆

以‘黄花水仙2号RNA反转录成的cDNA为模板，用特异引物进行PCR反应，PCR产物电泳检测。结果显示，5′RACE和3′RACE分别得到1条与预测相当约为600 bp的片段（见图1）。测序后将其同原始EST序列拼接，得到长度为1 122 bp的序列，开放阅读框945 bp，5′端非编码区85 bp，3′端非编码区92 bp，初步判断已经获得WRKY基因的cDNA全长。

2.2 ‘黄花水仙2号和‘金盏银台WRKY基因ORF的获得与分析

根据拼接的‘黄花水仙2号的cDNA全长，设计上下游引物，克隆‘黄花水仙2号和‘金盏银台WRKY基因的开放阅读框。结果扩增出大约1 000 bp的条带（见图1）。测序结果表明，‘黄花水仙2号ORF为945 bp，编码314个氨基酸；‘金盏银台ORF为951 bp，编码316个氨基酸。‘黄花水仙2号和‘金盏银台的WRKY基因分别命名为NtWRKY40a和NtWRKY40b。

2.3 多花水仙WRKY的生物信息学分析

利用ExPASy-ProtParam等在线工具推测2种水仙WRKY蛋白的基本理化性质（见表2），2种水仙WRKY都属于酸性和疏水性蛋白，且等电点均为5.09。由于氨基酸的个别差异，可能导致了它们在蛋白质分子量、分子式、GRAVY值和不稳定指数上的不同。综合推测2种类型的水仙WRKY蛋白均不存在信号肽，为非分泌蛋白。其跨膜螺旋数均为0，未形成跨膜区域，不是膜蛋白，且亚细胞均定位于叶绿体上的可能性比较大。

保守区域分析结果表明，该蛋白属于WRKY超基因家族的成员。对其开放阅读框所推导的氨基酸进行同源序列分析（见图2），黄花水仙2号同拟南芥（Arabidopsis thaliana，NP_178199.1）、葡萄（Vitis pseudoreticulata，AEN71143.1）、青蒿（Artemisia annua，ADI56655.1）、小麦（Triticum aestivum，AFW98256.1）、粳稻（Oryza sativa Japonica，NP_

001046094.1）的同源性分别为：45%、43%、47%、41%、43%，说明这个基因的保守性差；‘黄花水仙2号与‘金盏银台亦存在一定的差异，同源性为：97.27%。为了研究WRKY的进化关系，构建了WRKY的系统进化树（见图3），结果表明，‘黄花水仙2号和‘金盏银台处于同一分支，与‘黄花水仙2号进化比较相近的为粳稻，其次是大麦和小米，再就是玉米，二穗短柄草，它们都属于单子叶植物，与双子叶植物华东葡萄、苹果、青蒿等进化距离相对较远。总体上，此进化树与植物分类学基本一致。

2.4 多花水仙WRKY在不同发育期的表达分析

在多花水仙开花的过程中，同一品种不同时期WRKY基因表达量的结果显示（见图4）：NtWRKY40a的转录水平在花瓣（P）和副冠（C）上有类似的变化趋势，即在前花蕾期、始花期和盛花期呈上升趋势，在衰败期表现为下调；花瓣和副冠中相临花期NtWRKY40a基因表达量相差分别约为5倍和4倍，但C较P转录水平低。P和C中NtWRKY40b的表达量在花蕾、始花、盛花期差异不显著，差别较小，但在衰败期表现为明显差异，较前3花期比值分别为10和5倍左右，与NtWRKY40a相似，NtWRKY40b在C中的转录水平较P低。

3 讨论与结论

WRKY转录因子是植物转录调节的超基因家族之一，也是调控植物信号网络必不可少的部分。WRKY基因在植物中的表达是非组成性的，具有瞬时、迅速、组织特异性的特点。一般将WRKY蛋白分为3大类型：Ⅰ类含有2个WRKY保守结构域，锌指结构为C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H；Ⅱ类含有1个保守域，锌指结构与第Ⅰ类相同，目前已发现的WRKY大多数是此类型；Ⅲ类也有1个保守域，但锌指结构为C-X7-C-X22-23-H-X-C[4]。本研究中NtWRKY40a和NtWRKY40b均有1个WRKY保守域和1个锌指结构，因此属于第Ⅲ类WRKY蛋白。已研究的第Ⅲ类WRKY转录因子几乎全和植物的生物胁迫应答有关，2种水仙WRKY在开花过程中均呈现出一定的阶段性和时序性，可能是多花水仙参与自然共同进化及对不同环境适应性衍化的结果。

伴随植物的进化，衰老是不可避免的过程，通常被认为是细胞程序性死亡的一种类型并由细胞内外信号所控制[11]。目前，植物衰老的原因还不清楚，植物衰老研究对提高农业产品器官质量、作物增产及优良性状保持等有重大意义。已有的基因组和转录组结果显示，许多转录因子家庭基因参与了植物的衰老调控，如WRKY、bZIP、NAC和MYB等。Robatzek等[12]研究已经证明AtWRKY6与拟南芥叶片的衰老有关，不同器官的转录水平显示，AtWRKY6在根、花朵、衰老的叶片中有很高的表达量。也有研究者发现AtWRKY70的功能缺失突变体及OsWRKY23的过表达分别会加速拟南芥和水稻提前衰老[13-14]。本研究中，多花水仙WRKY基因的转录水平表明，花瓣和副冠中的NtWRKY40a在盛花期和衰败期表达量均最高，较花蕾期和始花期有明显差异，这可能与NtWRKY40a参与了‘黄花水仙2号花瓣的衰老过程有关；NtWRKY40b在花瓣和副冠的前3个时期的转录水平没有显著差异，而在衰败期表现出较大差异，这可能是衰老诱导了‘金盏银台花朵中WRKY基因表达量的增加。第4个时期的NtWRKY40b及整个花期的NtWRKY40a在花瓣和副冠中的转录水平差异很大，但具体相关机理尚不清楚，有待于课题组进一步研究。

随着研究的不断深入，WRKY转录因子的功能也日益揭示出来。近年来，WRKY基因的研究主要集中在拟南芥等模式植物和水稻等经济作用的基因克隆和功能分析中，而尚未涉及有关多花水仙WRKY基因的报道。本研究中，首次从多花水仙中分离出WRKY基因，并对其生物信息学进行初步分析，将有助于研究该基因功能，为下一步利用基因工程在转录水平上调控中国水仙的生长发育奠定了基础。

参考文献

[1] Jain M， Tyagi A K， Khurana J P. Genome-wide identification， classification， evolutionary expansion and expression analyses of homeobox genes in rice[J]. FEBS Journal， 2008， 275（11）： 2 845-2 861.

[2] 刘 强， 张贵友. 植物转录因子的结构与调控作用[J]. 科学通报， 2000， 45（14）： 1 465-1 474.

[3] Eulgem T， Somssich I E. Networks of WRKY transcription factors in defense signaling[J]. Current opinion in plant biology， 2007， 10（4）： 366-371.

[4] Eulgem T， Rushton P J， Robatzek S， et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors[J]. Trends in Plant Science， 2000， 5（5）： 199-206.

[5] Pandey S P， Somssich I E. The role of WRKY transcription factors in plant immunity[J]. Plant Physiology， 2009， 150（4）： 1 648-1 655.

[6] Ishiguro S， Nakamura K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein， SPF1， that recognizes SP8 sequences in the 5′upstream regions of genes coding for sporamin and β-amylase from sweet potato[J]. Molecular and General Genetics MGG， 1994， 244（6）： 563-571.

[7] Rushton P J， Macdonald H， Huttly A K， et al. Members of a new family of DNA-binding proteins bind to a conserved cis-element in the promoters of α-Amy2 genes[J]. Plant Molecular Biology， 1995， 29（4）： 691-702.

[8] Rushton P J， Torres J T， Parniske M， et al. Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes[J]. The EMBO Journal， 1996， 15（20）： 5 690.

[9] de Pater S， Greco V， Pham K， et al. Characterization of a zinc-dependent transcriptional activator from Arabidopsis[J]. Nucleic Acids Research， 1996， 24（23）： 4 624-4 631.

[10] 何炎森， 何玮毅， 陈晓静. 多花水仙花瓣抑制消减杂交 cDNA 文库的构建及分析[J]. 福建农林大学学报： 自然科学版， 2013， 42（3）： 289-296.

[11] Agarwal P， Reddy M P， Chikara J. WRKY： its structure， evolutionary relationship， DNA-binding selectivity， role in stress tolerance and development of plants[J]. Molecular Biology Reports， 2011， 38（6）： 3 883-3 896.

[12] Robatzek S， Somssich I E. A new member of the Arabidopsis WRKY transcription factor family， AtWRKY6， is associated with both senescence-and defence‐related processes[J]. The Plant Journal， 2001， 28（2）： 123-133.

[13] Ulker B， Mukhtar M S， Somssich I E. The WRKY70 transcription factor of Arabidopsis influences both the plant senescence and defense signaling pathways[J]. Planta， 2007， 226（1）： 125-137.

[14] Jing S， Zhou X， Song Y， et al. Heterologous expression of OsWRKY23 gene enhances pathogen defense and dark-induced leaf senescence in Arabidopsis[J]. Plant Growth Regulation， 2009， 58（2）： 181-190.

责任编辑：沈德发