树莓乙醇提取物抑菌活性研究

刘亚红++张婷婷++张敏

摘要： 研究以大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）、酵母（Yeast）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、黑曲霉（Aspergillums niger）、灰绿青霉（Penicillium glaucum）为供试菌，测定树莓（Rubus chingii Hu）乙醇提取物的抑菌活性。结果表明，树莓乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌具有比较显著的抑菌效果；在一定温度及pH范围内，其抑菌率与时间呈正相关；而在时间相同的情况下，其抑菌率与乙醇提取物浓度呈正相关。

关键词：树莓（Rubus chingii Hu）； 乙醇提取物； 抑菌活性

中图分类号：Q949.32；R151 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4485-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.024

树莓（Rubus chingii Hu），蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus L），广泛分布于江浙地区、以及南部沿海省份[1]。树莓的果实极具经济价值与药用价值，可以直接食用，也可以酿酒、做糖等；树莓的药用部位主要是其经干燥处理后的果实，主要功效是补肝、固精等。树莓果实中有大量树莓酸、β-谷甾醇等活性物[2-4]，有较为显著的温肾、抗氧化、延缓衰老功效[5-7]。

而针对树莓果实的提取物的抑菌功能研究则尚不多见，本研究将树莓乙醇提取物的抑菌圈和最低抑菌浓度做为评估标准，测试树莓果实的乙醇提取物对一些常见菌的抑菌能力[8]，在此基础上进一步测定在不同温度、不同pH条件下树莓乙醇提取液抑菌活性的变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

树莓乙醇提取物，其中树莓原料于2013年6月5～10日采集于江苏镇江地区，以沸水煮5 min，阴凉干燥处风干，用粉碎机粉碎，过0.25 mm筛，密封存于冰箱备用。大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）、酵母（Yeast）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、黑曲霉（Aspergillums niger）、灰绿青霉（Penicillium glaucum）。试验所需以上各菌种来自河北经贸大学生物与食品实验中心。

恒温培养箱（BPH-92722），购自上海精密仪器有限责任公司；高压灭菌锅（G154DW），为深圳博大精科有限责任公司产品；超净无菌操作台（VD-650），为北京华威兴业科技有限公司产品；干燥箱（202A-1），为南京莱步科技有限公司产品；磁力搅拌机（FCH202-S），为上海弗鲁克科学仪器公司产品；离心机（LW-250A），为浙江天恩仪器制造公司产品；旋转蒸发仪（RE2000E），为上海科升仪器有限责任公司产品；另有酒精灯、三角瓶、培养皿等。

1.2 试验方法

1.2.1 制备乙醇提取物 取已经制备好并过筛冷藏的树莓100 g，充分溶解于500 mL体积分数为75%乙醇溶液中。用搅拌机充分搅拌1.5 h，再用离心机进行离心分离，过滤后得到树莓乙醇提取液，以蒸发仪进行浓缩处理，减压真空干燥，得到树莓乙醇提取物备用。

1.2.2 制备培养基 采用PDA培养基，取马铃薯300 g，洗净，去除外皮，切块，入锅加水沸腾后，继续煮20 min，以8层纱布过滤，将所得滤物取葡萄糖20 g，琼脂20 g，搅拌均匀，定容至1 000 mL，置于灭菌锅中121 ℃灭菌30 min。

1.2.3 制备菌悬液 将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母、匍枝根霉、黑曲霉、灰绿青霉接种于培养基，置于30 ℃培养箱中培养，活化36 h，使其处于指数生长期后期，再选取处于一环位置的菌种，以RPMI 1 640培养液制成每种菌种的菌悬液，调整菌液浓度至107～108 CFU/mL。

1.2.4 制备滤纸片 取滤纸，用打孔器将其处理为半径3 mm的圆形纸片，置于干燥箱，设置250 ℃进行灭菌处理，取出冷却至常温，浸入树莓乙醇提取液，浸泡60 min，取出。

1.2.5 测定抑菌圈 在无菌操作台测定树莓乙醇提取液抑菌效果。将PDA培养基置于微波炉2 min使其熔化并冷却至常温凝固，然后在其表面均匀涂抹107～108 CFU/mL浓度的菌液，再把树莓乙醇提取液滤纸片贴放于涂抹菌液的培养基表面。每一菌种重复8次。在37 ℃恒温箱里培养48 h，以滤纸片抑菌圈直径描述树莓乙醇提取液的抑菌效果。

1.2.6 测定抑菌浓度 在10个试管中均注入3 mL液态培养基，然后在第1个试管里注入3 mL浓度为3.5 mg/mL的树莓乙醇提取液，搅拌均匀；再从第1个试管抽取3 mL液体注入第2个试管，以相同的方法进行到第9个试管，从而使前9个试管中树莓乙醇提取液浓度逐步下降，且容量维持在3 mL 。再把这9个试管均加入300 μL细菌，第10个试管不加细菌，为无菌对照。细菌培养后，考察树莓乙醇提取液最小抑菌浓度。

1.2.7 树莓抑菌效果的影响因素 pH的影响：以NaOH改变培养基的pH，分别调节pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，测量每一种细菌在树莓乙醇提取物作用下的抑菌浓度最小值。

温度的影响：取2 mL具有最小抑菌浓度的树莓乙醇提取液注入三角瓶，每个三角瓶里分别加入200 μL每种菌种的菌悬液，分别在25、45、60、75 ℃水浴锅中加热30 min，测定每种被试菌种最小抑菌浓度的抑菌效果，测定温度对树莓乙醇提取物抑菌效果的影响。

时间的影响：以去离子水将树莓乙醇提取物稀释到所需的浓度，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌3种菌种作为被试菌，测定不同浓度下的抑菌效果与作用时间的关系。

2 结果与分析

2.1 树莓乙醇提取物抑菌圈试验结果

由表1树莓乙醇提取物抑菌圈试验数据可知，树莓乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉4种被试菌种均有抑菌效果，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最为明显，抑菌圈直径达到12.75 mm，而抑菌效果相对小些的黑曲霉抑菌圈直径也达到了6.45 mm。对酵母、匍枝根霉及灰绿青霉则未测出显著抑菌效果。

2.2 树莓乙醇提取物最低抑菌浓度

由表2可知，树莓乙醇提取物具有较为明显的抑菌效果。测量得到对各类被试菌种的抑菌浓度最小值，对大肠杆菌的抑菌浓度最小值为0.16 mg/mL，对枯草芽孢杆菌的抑菌浓度最小值为0.16 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的抑菌浓度最小值为0.34 mg/mL，对黑曲霉的抑菌浓度最小值为0.64 mg/mL。由综合抑菌浓度最小值及表2可知，树莓乙醇提取物对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果较好，而对灰绿青霉的抑菌效果则较弱。

2.3 树莓抑菌的影响因素

2.3.1 pH的影响 由表3可知，当pH≤6.0时，均未发现被试菌种，说明抑菌效果显著；pH为7.0时，部分被试菌种（酵母、匍枝根霉、灰绿青霉）开始检出，说明树莓乙醇提取物抑菌活性开始降低；pH为9.0时，所有被试菌种均被测出，说明树莓乙醇提取物抑菌活性显著下降。因此树莓乙醇提取物抑菌活性在pH≤6.0时更容易发挥。

2.3.2 温度的影响 由表4可知，当温度从25 ℃升高到75 ℃过程中，温度对树莓抑菌并无明显影响。故可知，温度对树莓乙醇提取物的抑菌效果无明显影响。

2.3.3 时间的影响 选取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌3种菌种作为被试菌，测定不同浓度情况下抑菌效果与作用时间的关系。图1、图2和图3分别是3种被试菌种的抑菌率测定结果，其中横坐标表示树莓乙醇提取物浓度（mg/mL），纵坐标表示抑菌率（%）。

由图1-3数据可知，随着作用时间的延长，树莓乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌3种菌种抑菌率均有所提升，抑菌率与时间呈正相关。其中对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最为显著，在浓度相同的情况下，树莓乙醇提取物对金葡菌抑菌率显著高于其他2种被试菌种。

3 小结与讨论

树莓的乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌具有比较显著的抑菌效果，对黑曲霉抑菌效果一般，而对酵母、匍枝根霉、灰绿青霉则没有明显效果；同时证实在一定温度范围及pH范围之内（75 ℃范围内，pH 3.0～9.0），树莓乙醇提取物的抑菌率与时间呈正相关；而在时间相同的情况下，树莓乙醇提取物的抑菌率则与乙醇提取物浓度正相关。

基于植物的杀菌产品其主要成分均是复合抑菌成分，而作用的位点及机制也不尽相同，最大的优势是环保，是当前农药领域的研究热点，本研究证明树莓对各类细菌具有抑制效果，能够在天然抑菌产品中发挥作用，发展前景可期，可以为植物杀菌产品的研发制作提供借鉴。

同时由于天然植物的无公害农药的抑菌机理目前仍然处于初级研究阶段，没有系统的研究成果，研究的方式和方法尚需进一步探索，也需要其他相关学科进行互补，以获取进一步的成果。

参考文献：

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