采后荔枝果皮中谷胱甘肽转移酶基因的表达与酶活分析

张建平 贾彩红 王家保 徐碧玉

摘 要 为探明荔枝谷胱甘肽转移酶基因（LcGST）的表达与果皮褐变之间的关系，在荔枝cDNA芯片中获得了荔枝LcGST全长cDNA序列（ABR15777）。该序列全长913 bp，5′-UTR长53 bp，3′-UTR长215 bp，含一个645 bp的完整开放阅读框，编码含214个氨基酸残基的多肽。该氨基酸残基序列与沙梨等物种的谷胱甘肽转移酶蛋白相似性较高。基因表达分析表明，LcGST在常温储存条件下基因的最大表达量出现在24 h，在保湿储存条件下，LcGST的最大表达量出现在48 h。GST酶活性测定结果表明，在常温储存条件下酶活性的最大值出现在24 h，在保湿储存条件下酶活性的最大值出现在48 h。说明LcGST在荔枝果皮褐化过程中起重要作用。

关键词 荔枝；胱甘肽转移酶基因；表达；酶活

中图分类号 S667.1 文献标识码 A

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）果实采后会快速褐变，降低其商品价值[1]。荔枝采后果实迅速失水，果皮逐渐干裂，产生大量活性氧及自由基，这些活性氧及自由基导致膜脂过氧化的加速，同时荔枝果皮迅速褐变，因此，活性氧及自由基在荔枝采后果皮褐变过程中起着主要作用。有研究报道，植物体在受到胁迫后，植物体内会产生大量活性氧及自由基，而为了防止活性氧类和自由基的损伤，植物体内谷胱甘肽转移酶（glutathione-S-transferase， GST）的含量会上升，催化清除植物体内的自由基，使植物免受损伤[2]。

GST是一种多功能酶，主要用于催化三肽的谷胱甘肽与疏水的、亲电的化合物发生亲电取代反应，而后通过选择性ABC转运蛋白将连有谷胱甘肽的代谢物质转运入液泡，达到消除毒素的作用[3]。GSTs二聚体由结构域Ⅰ和结构域II两部分组成，两者之间由5～10个氨基酸残基组成的可变连接区连接。结构域Ⅰ是还原型谷胱甘肽（GSH）的特异接合位点（G位点），由1组N-末端氨基酸残基组成，结构域II是结合疏水性底物的位点（H位点），由C-末端氨基酸残基组成[4]。GSTs最初是在20世纪60年代在动物体内首先被发现的[5]，随即70年代，人们在玉米中发现了第一个植物的GST酶，从此，便逐渐在所有的动植物以及细菌、真菌中都发现了与GSTs相对应的酶或基因序列[5-6]。根据蛋白质的序列相似性、底物专一性、酶联免疫反应、动力学特征、空间结构和是否能组成二聚体等特征，可以将植物GSTs基因家族分为8个类型，分别是Zeta、Theta、Tau、Phi、Lambda、DHAR（dehydroascorbate reductase）、TCHQD（etrachlorohydroquinone dehalogenase）和 EF1Bγ（the γ-subunit of the eukaryotictranslation elongation factor IB）[7]，其中Phi、Tau、Lambda和DHAR四类GSTs是植物所特有的[8]，Tau类和Phi类GSTs在植物中的分布最为广泛，其中Phi类基因在植物的抗逆反应、细胞信号转导、植物抗病等方面都发挥着重要作用[8-10]。西红柿中的GST能阻止其体内的氧化伤害，抑制 Bax 蛋白诱导的细胞程序性死亡[11]。这表明有些GST在稳定细胞的氧化还原和调节细胞的程序性衰老方面起作用。

目前关于荔枝GST基因的研究报道较少，为进一步研究GST基因在荔枝采后果皮衰老过程中的作用机理，本研究从cDNA芯片中获得了荔枝GST基因全长LcGST，并分析其序列特征，研究在常温储存和保湿储存条件下GST基因的表达情况，并测定在常温储存和保湿储存条件下的酶活性，探讨果皮褐变与GST基因表达之间的关系，为进一步揭示果皮褐变机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 荔枝（妃子笑）采自华南热带农业大学果园（海南省儋州市宝岛新村）。选摘生长健康，没有病害，没有虫害，成熟度基本一致（雌花授粉受精后约70～90 d）的果实为试验材料。

果实采后3 h运回实验室，清水冲洗，自然晾干（约10 min左右），挑选大小基本一致、无病虫害和机械损伤的果实用作处理。第一组放置于（25±1）℃温度下贮藏，环境空气相对湿度（70±5）%培养箱中储存（常温储存处理）；第二组用保鲜膜封闭包装后同样放置于（25±1）℃温度下贮藏，环境空气相对湿度（70±5）%培养箱中储存（保湿储存处理）。两组材料在一定时间段的时候，剥下果皮，放入液氮中速冻，于-70 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 试剂 菌种E.coli DH5α由中国热带农业科学院热带生物技术研究所保存。cDNA合成试剂盒购自CLONTECH公司，dNTPs、Taq DNA聚合酶购自上海申能博彩生物科技有限公司，引物合成委托上海生工生物工程技术服务有限公司，DNA回收试剂盒购自TIANGEN公司，克隆载体试剂盒pMD20-T Vector购自TAKARA公司。其它生化试剂和常规试剂均为分析纯或超纯。

1.2 方法

1.2.1 荔枝果皮总RNA提取 荔枝果皮总RNA 的提取采用改良CTAB法的步骤进行[12]。提取的总RNA根据Clonetech提供的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书，将10 μg总RNA反转录为单链cDNA。

1.2.2 荔枝果皮GST基因的获得 GST基因根据本课题组荔枝cDNA芯片测序获得的，将该基因序列进行BLAST比对发现，该基因为全长序列。根据基因序列设计引物，从cDNA中克隆GST基因的全长。GST基因的引物：5′端引物为：5′-ATGG

TGGTTAAAGTTTATGGAC；3′端引物为：CTAATAG

TAGGCAAGCTTCAT。PCR扩增按以下操作进行：在每个0.2 mL离心管中加入4 μL dNTP，5 μL 10×Taq buffter， 0.5 μL Taq酶，2 μL 5′端引物，2 μL 3′端引物，1 μL单链cDNA及33.5 μL无菌双蒸水，总体积50 μL。94 ℃预变性3 min，94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环后，72 ℃终延伸10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用DNA回收试剂盒回收目的条带，克隆到pMD20-T Vector载体上，序列送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.3 GST基因的RT-PCR半定量分析 根据GST基因和actin基因序列设计半定量PCR引物，每个基因片段大小在300 bp左右。GST基因5′端引物为：5′-CCTTTTGGGCAAGTTCCAGTAAT-3′；3′端引物为：5′-GCACCAACTTAACATCCTCCGTC-3′。actin基因5′端引物为：5′-ATCCTCCAATCCAG

ACACTGT-3′；3′端引物为：5′-CAGTGGTCGTACA

ACTGGTAT-3′。PCR扩增按以下操作进行：在每个0.2 mL离心管中加入12.5 μL PCR-Mix缓冲液，1 μL 5′端引物，1 μL 3′端引物，1 μL单链cDNA及9.5 μL无菌双蒸水，总体积25 μL。94 ℃预变性3 min；94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。

1.2.4 GST酶活性测定 取-70 ℃冰箱中保存的不同处理时间点（0、24、48、72 h）的果皮作为材料，每个处理样品随机选30片果皮，在每片果皮上随机切取一部分，把切取的各部分混合，作为1个处理的实验材料。所有处理重复3次。取上述处理的果皮，加入液氮和2% PVPP研磨，取大约1 g粉末转入pH 7.8的50 mmol/L PBS缓冲液（含0.2 mmol/L EDTA和2 mmol/L的抗坏血酸），用冰冷却。再12 000 g离心20 min，提取上清液用于测定酶的活性。酶活测定用1.5 mL反应液，1.5 mL反应体系中含：1.5 mL 50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0），75 μL 100 mmol/L的GSH，15 μL GST待测液，然后加入75 μL 100 mmol/L的CDNB启动反应，以不加CDNB的空白管为对照，测定OD340的变化。酶活单位：每分钟催化1 μmol CDNB结合GSH的酶量为1个单位（1 U）[13]。

2 结果与分析

2.1 LcGST的序列分析

利用NCBI软件对LcGST进行序列分析，发现荔枝果皮GST基因cDNA全长933 bp（GenBank登录号为ABR15777），包含一个645 bp的完整开放读码框，编码214个氨基酸多肽，5′（5′UTR）端含有一个53 bp的非编码区序列，3′（3′UTR）端含有一个235 bp的非编码区序列（图1）。该基因编码蛋白由结构域Ⅰ和结构域II两部分组成，结构域I是谷胱甘肽（GSH）特异性结合位点（G位点，图1中红色框），结构域II是疏水底物的结合位点（H位点，图1中蓝色框），符合GST基因的特征（图1），因此将其命名为LcGST。

Blastx比对结果表明，该基因推导的氨基酸残基序列与沙梨、可可、苜蓿、葡萄和毛果杨蛋白序列相似性分别为72%、69%、68%、68%和67%，并且与他们的序列聚为一支（图2）。

2.2 LcGST在常温储存和保湿储存条件下的表达分析

利用半定量PCR对LcGST在常温储存条件下荔枝果皮中的表达情况进行分析，从图3中可以看出，常温处理的荔枝果皮LcGST相对表达量是先上升后下降的过程，在0～24 h之间是上升的过程，随后表达量下降。

此外对LcGST在保湿处理条件下荔枝果皮中的表达进行了分析，从图4中看出在保湿处理的条件下，荔枝果皮LcGST相对表达量在0～48 h之间其表达量逐渐升高，在48 h达到最高峰，接着降低。

2.3 GST酶活性的测定

对常温储存和保湿储存处理后荔枝果皮中GST酶的活性进行测定，结果表明，常温储藏条件下GST酶活性在24 h迅速升高，酶活性达到一个峰值，随后逐渐下降。保湿储藏条件下GST酶活性没有明显的变化（图5）。

3 讨论

本研究在cDNA芯片的基础上获得了荔枝谷胱甘肽转移酶LcGST的全长cDNA 序列（ABR15777），该序列推导的氨基酸残基具谷胱甘肽（GSH）特异性结合位点（G位点）和疏水底物的结合位点（H位点），符合GST酶的特征。Blastx比对分析该氨基酸序列与沙梨的氨基酸序列一致性达72%。经过ExPASy网站ProtParam工具分析，LcGST基因编码的蛋白质理论等电点为5.31，分子量为24.49 kD。

有研究结果表明，果皮褐变与果实失水有关[14-15]。果实失水主要发生在果皮[16-17]。随果皮失水量增加，果皮褐变指数升高[16-20]，二者呈明显正相关[16]。随果皮失水量增加，果皮pH升高，高湿贮藏环境下果皮含水量高，pH上升较慢[16-17]，果皮褐化现象也较慢。这些结果说明果皮失水是导致果皮褐变的主要原因之一[21]。GST提供的过氧化物清除能力的提高在防止植物遭受胁迫诱导产生的氧化损伤过程中可能是一个关键因子[22]。本研究对GST基因在常温储存和保湿储存下荔枝果皮中的表达进行分析，结果表明：在常温储存条件下，GST基因在24 h时表达量最大，而此时也是荔枝果皮开始褐化的时间；在保湿储存的条件下，GST基因表达量的最大值出现在48 h，这在基因表达水平上初步说明了荔枝果皮褐变与GST基因有关。同时对GST酶的活性进行测定，结果表明在常温储存的条件下，荔枝在采后24 h内开始褐变的同时[21]，GST的酶活性达到一个峰值，此时荔枝的褐变指数也缓慢增加[23]，这初步说明在常温储存条件下，果皮失水、氧化严重，为了防止果皮褐化，防止活性氧类的损伤，荔枝果皮内的谷胱甘肽转移酶（GST）的含量上升，从而催化清除果皮体内的自由基组织以防止果皮褐化。在后期荔枝果皮严重褐变则主要是由于酚类物质的酶促或非酶促反应生成黑色物质的累积所致[17]，而不受果皮内谷胱甘肽转移酶的影响，所以后期GST酶的活性下降。在保湿储存的条件下，荔枝果皮的褐化程度较慢，在储存前3天荔枝果皮基本没有褐化，荔枝果皮中的自由基含量很少，不需要GST酶清除果皮中的自由基，所以GST酶的活性一直保持较低的水平。这从生理学水平上也初步说明荔枝褐化与GST酶的活性相关。

综上所述，GST基因的表达与酶活变化趋势相吻合，说明在荔枝果皮褐化过程中GST酶在其过程中起作用，但GST酶在果皮褐变过程中具体起什么作用，还需进一步研究证实。

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责任编辑：赵军明