二穗短柄草2C型蛋白磷酸基因BdPP2C1的克隆及表达分析

颜彦 胡伟

摘 要 从二穗短柄草中扩增得到一个2C型蛋白磷酸酶基因，命名为BdPP2C1。BdPP2C1与拟南芥中PP2C家族进行系统进化分析，结果表明，BdPP2C1与拟南芥A类PP2C家族成员的亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR表达分析系统，分析在非生物逆境胁迫及相关信号分子处理下BdPP2C1基因的表达情况。结果表明：该基因的表达受脱落酸（ABA）和双氧水抑制，并且受渗透和低温胁迫诱导。因此，BdPP2C1是非生物逆境胁迫中的一个应答因子，并且可能受相关信号分子调控。

关键词 短柄草；PP2C；克隆；表达

中图分类号 Q344 文献标识码 A

由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白质的磷酸化和去磷酸化不仅是生物体内代谢调节的重要途径，而且也在细胞信号转导过程中发挥着重要作用。此前的研究热点主要集中在蛋白激酶上[1-4]，但近几年的研究结果发现，蛋白磷酸酶在信号转导中也起着非常重要的调控作用，尤其体现在植物对高盐、干旱及低温等环境胁迫所诱导的信号转导途径中[5]。2C型蛋白磷酸酶（Protein Phosphatase 2C， PP2C）是蛋白磷酸酶中的一大类，它广泛地参与基因转录调控、蛋白质翻译及翻译后修饰、细胞周期调节、细胞凋亡信号调控、支链氨基酸的代谢、植物的生长发育及环境胁迫应答等多种生物学过程。PP2C通过催化去磷酸化作用负调控蛋白激酶级联信号系统。H2O2、不饱和脂肪酸、Ca2+/CaM、脂质信号分子等均可调节 PP2C的活性[6]。目前，已从多个物种中鉴定出了PP2C家族基因，其中人类基因组中有15个，线虫中有8个，果蝇中有10个，酵母菌中仅有7个，而在拟南芥中发掘出80个[7-8]，在水稻中鉴定出了78个PP2C家族的基因[3]，但其中绝大部分基因的功能还未得到深入的研究[9-10]。

二穗短柄草（Brachypodium distachyon L.）与黑麦草（Lolium perenne L.）、 小麦（Triticum aestivum L.）、 大麦（Hordeum vulgare L.）和燕麦（Avena sativa L.）等同属于早熟禾亚科，基因组序列与这些作物高度相似[11-13]。二穗短柄草具有植株个体小、生长周期短、自花受精、易被转化、基因组小（约355 Mb）及存在不同倍性的基因组等特点，所以，二穗短柄草被麦类、牧草及能源植物研究者推选为研究温带禾本类植物的模式植物。二穗短柄草全基因组序列测定的完成，为其在基因组水平上的研究提供了便利[14]。然而，二穗短柄草中PP2C基因的研究尚未见报道。

本研究对二穗短柄草BdPP2C1基因进行克隆、序列分析、进化关系分析，并对其在逆境胁迫及多种信号分子处理下的表达模式进行研究。结果表明BdPP2C1基因可能参与逆境胁迫及相关信号分子的信号转导途径，为进一步利用转基因的方法鉴定BdPP2C1基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 二穗短柄草种子由本实验室保存。将二穗短柄草种子播种在花盆中（营养土和蛭石比例为3 ∶ 1），生长6周后，取其叶片进行基因克隆和表达分析。

1.1.2 主要试剂 PEG6000、NaCl、脱落酸（ABA）等生化试剂购自上海生工生物工程有限公司，RNA提取试剂盒购自天根生物科技公司，反转录试剂盒购自Fermentas公司，实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司，PCR试剂购自康为世纪生物公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的获得 根据二穗短柄草数据库中的序列信息（www.phytozome.org）设计1对引物（P1：ATGGCGGAGATTTGCAGCG；P2：TCACGGC

CTCGGGCGGCGC）。利用6周大的短柄草叶片RNA反转录的cDNA第一链为模板，PCR扩增该基因开放阅读框（ORF）全长；PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收扩增片段；将回收的片段利用T4DNA连接酶连接到PMD18-T载体上，热激转化到大肠杆菌Top10；挑单菌落进行LB液体培养，碱裂解法提取质粒，进行PCR鉴定；将鉴定的阳性克隆进行测序。

1.2.2 生物信息学分析 利用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列比对和结构预测，利用ORFFinder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）和GENSCAN（http：//genes.mit.edu/GEN

SCAN.html）进行开放阅读框预测，利用MEGA软件进行进化树构建。

1.2.3 BdPP2C1基因的表达分析 6周大的短柄草幼苗用20% PEG6000、100 mmol/L NaCl、4 ℃低温、100 μmol/L ABA、100 μmol/L乙烯、10 mmol/L H2O2分别处理0、1、3、6、12、24 h，提取叶片RNA，反转录成cDNA。以cDNA第一链为模板。为避免基因组DNA的污染，在RNA的提取过程中进行了基因组DNA的消化。实时荧光定量PCR采用TaRaKa公司的试剂盒，染料为SYBR Green，在吉泰生物科技有限公司Mx 3005P荧光定量PCR仪上进行。以短柄草Actin基因为内参。定量方法为2-ΔΔCt法：ΔΔCt=（CT， Target-CT， Actin）Time x-（CT， Target-CT， Actin）Time 0[15]。扩增所用引物的序列分别为：P3（BdPP2C1）：AACTGTCGCCTGCTGTTTCG；P4（BdPP2C1）：CTTCCTGGACGCCTCCTCAT；P5（BdActin）CCCGATGGACAGGTTATCACTA；P6（BdActin）

ATAGAGCCACCAATCCAAACAC。引物设计参考TaKaRa实时荧光定量标准说明书。为了保证引物的特异性，引物设计在UTR区域，PCR产物的长度维持在300 bp以内。用于实时荧光定量PCR的引物均由上海生工生物工程有限公司合成。荧光定量PCR的反应程序如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性7 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，循环40次。

2 结果与分析

2.1 目的基因的克隆及序列分析

从二穗短柄草数据库中发现1个1 218 bp的cDNA序列，通过ORF Finder和GENACAN软件分析结果表明，该cDNA序列有1个翻译起始密码子ATG，相同读码框内有1个终止密码子TGA，表明此序列是一个全长基因（图1）。该基因开放阅读框（ORF）编码405个氨基酸。随后，根据该cDNA序列设计2条引物，从PEG6000渗透处理6 h的RNA反转录的cDNA第一链模板中克隆了该基因全长。测序分析结果表明，所克隆的cDNA序列与数据库中的序列有99%的一致性，将其命名为BdPP2C1。BLASTX分析结果表明，BdPP2C1 cDNA与粗山羊草（EMT07491.1）、狗尾草（XP_004984925.1）、小麦（EMS59347.1）PP2C家族基因有较高的一致性，分别为82%、81%、78%。利用MEGA软件，生成系统进化树，其中包括80个拟南芥PP2C家族成员（图2）。这些PP2C家族成员包含了A-L类PP2C。从进化树结果可以看出，短柄草BdPP2C1与AtPP2C78、AtPP2C37、AtPP2C24、AtPP2C3聚在同一支上，与AtPP2C78亲缘关系最近。上述结果表明本研究所克隆的cDNA序列为短柄草PP2C家族基因。

2.2 BdPP2C1基因在信号分子处理下的表达分析

在乙烯处理条件下，BdPP2C1基因的表达没有显著变化（图3-B）；在ABA处理条件下，该基因的表达在处理1 h被诱导，在处理3、6、12、24 h被抑制，在处理24 h达到最小值（图3-A）；在H2O2水处理条件下，处理1、3、6、12、24 h，BdPP2C1基因的表达均显著被抑制（图3-C）。上述结果表明，BdPP2C1能够被逆境胁迫相关的信号分子ABA和双氧水调控。

2.3 BdPP2C1基因在非生物逆境胁迫下的表达分析

在NaCl处理条件下，BdPP2C1基因的表达没有显著变化（图4-A）；在PEG6000处理条件下，处理1、3、6、12、24 h，该基因的表达均能被显著诱导，并表现出先上升后下降的趋势，在处理6 h达到最大值（图4-B）；在低温处理条件下，处理3、6、12、24 h，该基因的表达能被显著诱导，并表现出逐渐上升的趋势，在处理24 h达到最大值（图4-C）。上述结果表明，BdPP2C1基因能够参与逆境胁迫，显著受渗透和低温胁迫诱导。

3 讨论与结论

在低温、干旱、高盐等逆境胁迫下，植物通过调节特定基因的表达进而引起一系列的生理生化变化，以适应环境的多变性。已有研究证实植物体内存在依赖ABA和不依赖ABA这2种信号途径来调节基因的表达以应对胁迫环境[16-17]。ABA作为一种关键的植物激素，在逆境胁迫尤其是在干旱和高盐的环境下发挥着重要的调节作用，而由蛋白激酶和蛋白磷酸酶介导的蛋白质的磷酸化和去磷酸化在ABA信号途径中起着非常重要的作用。高等植物中PP2C广泛参与依赖ABA的多种生理过程，包括ABA诱导的种子萌发、气孔关闭、幼苗根系的伸长、抗病原菌侵害、生长发育及逆境胁迫等。

近年来，ABA信号途径的研究取得了较大的进展。在拟南芥中已经建立了较为完善的ABA信号转导途径。在这一信号转导途径中存在3个组分：PYR/PYL/RCAR（ABA受体）、 PP2C（负调控因子）、SnRK2（正调控因子）。这3个组分形成一种双负调控系统：在没有ABA存在的时候，PP2C通过直接地去磷酸化的方式抑制SnRK2；在有ABA存在的时候，ABA与受体PYR/PYL/RCAR结合，促进了PYR/PYL/RCAR与PP2C的相互作用，从而抑制PP2C并激活SnRK2[18]。因此，PP2C在ABA信号转导过程中起着关键作用。在环境胁迫发生时，植物为了应对环境胁迫开启了多种信号通路，包括ABA信号通路。因此，PP2C也通过ABA信号途径在植物应答环境胁迫过程中起着重要作用。

植物中对于PP2C的报道主要集中在拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）中，Schweighofer等[5]报道了拟南芥中76个PP2C基因，并将它们分成10个组；Xue等[8]利用生物信息手段从拟南芥和水稻基因组中分别分离出80和78个PP2C，并分别将它们分为13和11个组。本研究扩增得到的BdPP2C1基因ORF为1 218 bp，编码405个氨基酸。序列分析结果表明，BdPP2C1与其他物种中PP2C基因具有较高的一致性。进化分析结果表明，BdPP2C1与拟南芥AtPP2C78、AtPP2C37、AtPP2C24、AtPP2C3聚在同一支上。这些拟南芥PP2C基因都属于A类PP2C家族基因[8]，因此，本研究所克隆的BdPP2C1是一个A类二穗短柄草PP2C基因。

先前的研究结果表明，拟南芥A类PP2C能够在转录水平被ABA诱导[8]，而拟南芥A类PP2C酶活力在翻译后水平被抑制，从而作为负调控因子参与ABA信号转导途径[18]。本研究中，BdPP2C1的表达在ABA处理1 h被诱导，而在ABA处理3～24 h被抑制。这些结果暗示着BdPP2C1的表达在处理早期响应ABA刺激上调表达，但随着处理时间的延长，为了促进其酶活被抑制而在转录水平表现出被ABA抑制。因此，BdPP2C1可能是ABA信号转导途径的负调控因子。植物体内ABA的积累会诱导双氧水的产生，双氧水也作为一种信号分子参与多种生理过程。本研究结果也表明双氧水能抑制BdPP2C1的表达。这一结果暗示着ABA介导的双氧水的产生也可能是调控BdPP2C1的一种方式。

逆境胁迫会导致植物体内的代谢水平发生显著变化，一些信号分子会显著积累，如ABA、乙烯、双氧水。这些信号分子在调控植物对逆境胁迫的适应过程中起着至关重要的作用。BdPP2C1能够受到信号分子调控暗示着该基因也可能参与植物对逆境胁迫的应答。本研究结果表明，BdPP2C1的表达在PEG处理下表现出先上升后下降的趋势，但总体上能够被PEG诱导，在处理6 h达到最大值。这一结果暗示着BdPP2C1能够快速响应渗透胁迫，并达到最大值，随后表达水平降低。植物对逆境胁迫信号的转导存在对信号的激活放大与失活关闭[5]。BdPP2C1对渗透胁迫应答的趋势符合植物对逆境胁迫应答的基本模式。另外，BdPP2C1的表达对低温胁迫的响应表现出逐渐上升的趋势，表明BdPP2C1对低温胁迫的应答较为缓慢。虽然PP2C是ABA信号途径的负调控因子，但PP2C参与逆境胁迫表现出较为复杂的模式。过表达山毛榉PP2C2降低了拟南芥对非生物逆境胁迫的耐受性[19]。然而，拟南芥PP2CG1和玉米PP2C2被报道能够正调控植物对高盐和低温胁迫的耐受性[20-21]。上述结果表明，PP2C可能作为正调控或者负调控因子参与非生物逆境胁迫，其原因可能是PP2C能够通过多种信号途径参与植物对非生物逆境胁迫的应答。

短柄草是一种新型的模式植物，开展短柄草基因结构和功能的研究能够促进禾谷类粮食作物的遗传改良[22]。对短柄草PP2C家族的BdPP2C1基因功能的深入研究，将有助于理解植物对逆境胁迫的应答机制。在随后的研究工作中，将利用RNAi或过量表达的方法构建转基因株系，通过表型分析、生理学分析、调控途径分析阐明BdPP2C1在逆境胁迫中的功能及作用机制。

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责任编辑：黄东杰