白芨多糖的抑菌作用研究
2015-10-23代建丽周斯荻刘铭轩等
代建丽+周斯荻+刘铭轩等
摘 要：以水提醇沉法提取白芨多糖，应用滤纸片法研究白芨多糖对大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长抑制作用，并测定大肠杆菌菌液的电导率、碱性磷酸酶含量和蛋白质含量探讨白芨多糖的抑菌机理。结果表明，白芨多糖对4种菌的生长均有抑制作用，20mg/mL的白芨多糖抑菌效果较好，白芨多糖可导致大肠杆菌细胞壁和细胞膜的通透性增大，引起细胞内容物外泄而起到抑菌作用。
关键词：白芨多糖；抑菌活性；抑菌机理
中图分类号 Q946.3 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）19-19-03
Study on the Antibacterial Activity of Bletilla striata Polysaccharide
Dai Jianli et al.
（College of Life Science，Wuchang University of Technology，Wuhan 430223，China）
Abstract：Water-soluble polysaccharides were separated from Bletilla striata by hot-water extraction and its antibacterial activity against Escherichia coli，Proteus vulgaris，Staphyloccocus aureus and Bacillus subtilis were studied with filter method. The changes in electric conductivity，alkaline phosphatase（AKP）content and protein concentration in the medium were measured to study the antibaeterial mechanism. Results showed that the polysaccharides of Bletilla striata had antibacterial activity against the four bacteria and had strong inhibition effect at the concentration of 20mg/mL. The permeability of cell membrane and cell wall of Escherichia coli were increased after treated with Bletilla striata polysaccharide，which resulted in the release of cell components.
Key words：Bletilla striata polysaccharide；Antibacterial activity；Antibaeterial mechanism
中药白芨为兰科植物白芨（Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.）的干燥块茎，具有收敛止血、消肿生肌之功效，临床上广泛用于治疗咳血、吐血、溃疡疼痛、手足皲裂等症。现代研究显示，白芨的主要药用成分为白芨胶，又称白芨多糖[1]。白芨甘露聚糖胶浆对人上消化道出血有良好的止血疗效[2]。白芨多糖能促进大鼠背部切割伤创面的创伤愈合[3]，并能促进大鼠应激性胃溃疡的愈合[4]。但是，有关白芨抑菌作用的研究较少。目前有少量研究表明白芨提取物具有抑菌效果，Michinori等发现白芨的乙醇浸提液对黄色葡萄糖菌和枯草杆菌有抑制作用[5]，陈玉等发现白芨水煎剂能抑制变形链球菌的生长[6]，白芨中起抑菌作用的有效成分及其抑菌机理尚缺乏研究。植物多糖作为一类重要的生物活性物质，已在许多种属中被证明具有抑菌作用[7-10]。本实验对白芨多糖的抑菌作用和机理进行了初步研究，以拓展中药白芨的药用范围。
1 材料与方法
1.1 材料 白芨购自武汉国药股份有限公司中药饮片厂；金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、变形杆菌（Proteus vulgaris）购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，武昌理工学院生科院实验室活化保存。
1.2 方法
1.2.1 白芨多糖的提取及含量测定 白芨饮片粉碎、过筛，称取30g，按1∶20（W/V）比例加入蒸馏水，80℃浸提2h，重复提取3次，合并提取液，过滤，滤液于旋转蒸发仪中减压浓缩至稠膏状，加3倍体积95%乙醇沉淀。过滤，取沉淀，加10mL蒸馏水溶解，Sevag法脱蛋白，透析，再次加入3倍体积95%乙醇沉淀。过滤，取沉淀，50℃干燥得白芨多糖。以葡萄糖制作标准曲线，苯酚硫酸法测定多糖含量[11]。
1.2.2 白芨多糖的抑菌试验 将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和变形杆菌用LB活化，同时将白芨多糖稀释成5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL4种浓度的多糖溶液，过滤除菌备用。试验时采用滤纸片法[7]测定白芨多糖的抑菌效果，以无菌水为阴性对照，25μg/mL氯霉素为阳性对照，4种多糖溶液为处理组进行抑菌试验，菌液浓度为108CFU/mL。以抑菌圈的大小表示抑菌活性的大小。
1.2.3 白芨多糖对大肠杆菌细胞膜通透性的影响 将白芨多糖用适量蒸馏水溶解，过滤除菌，加入到LB液体培养基中使其终浓度40mg/mL备用。将震荡培养至对数生长期的大肠杆菌菌液调整浓度为108CFU/mL，转入加有白芨多糖的LB培养基中振荡培养，分别于0、1h、2h、3h、4h测定菌液的电导率[12]，以不加白芨多糖的培养基为对照。
1.2.4 白芨多糖对大肠杆菌细胞壁通透性的影响 将白芨多糖加入到LB液体培养基中使其终浓度为40mg/mL。调整培养至对数生长期的大肠杆菌菌液使其浓度为108CFU/mL，转入到含有40mg/mL白芨多糖的LB培养基中振荡培养，分别于0、1h、2h、3h、4h取样5mL，3 500r/min离心10min，取上清液20μL用碱性磷酸酶检测试剂盒和酶标仪测定碱性磷酸酶的含量[13]，以不加白芨多糖的培养基为对照，酶活性单位为DEA单位。
1.2.5 白芨多糖对大肠杆菌培养液中蛋白质浓度的影响 将白芨多糖加入到LB液体培养基中使其终浓度为40mg/mL。调整培养至对数生长期的大肠杆菌菌液使其浓度为108CFU/mL，转入到含有40mg/mL白芨多糖的LB培养基中振荡培养，分别于0、1h、2h、3h、4h用Bradford法测定菌液中的蛋白质含量[14]，以不加白芨多糖的培养基为对照。
2 结果
2.1 白芨多糖的提取及含量测定 采用水提醇沉法从30g白芨饮片粉末中获得5.56g白芨粗多糖，苯酚硫酸法测得多糖质量为4.62g，粗多糖中多糖含量为83.1%，多糖得率为15.4%。
2.2 白芨多糖的抑菌效果 采用滤纸片法测定白芨多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和变形杆菌的抑菌作用，以25μg/mL氯霉素为阳性对照，实验结果表明，在40mg/mL浓度范围内，白芨多糖对四种菌的生长都有一定的抑制作用。在低浓度即多糖浓度为5mg/mL时白芨多糖对四种菌的抑制作用均不明显，糖浓度为10mg/mL时对枯草芽孢杆菌和变形杆菌表现出较强的抑制作用，20mg/mL时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出较强的抑制作用，高浓度即多糖浓度为40mg/mL时对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌表现出较强的抑制作用，其中，白芨多糖对大肠杆菌的抑制作用超过了阳性对照氯霉素（图1）。
A：阴性对照；B：氯霉素阳性对照；C：大肠杆菌；D：变性杆菌；
E：枯草芽孢杆菌；F：金黄色葡萄杆菌
图1 白芨多糖对四种细菌的抑菌效果
2.3 白芨多糖对大肠杆菌细胞膜通透性的影响 经白芨多糖处理后，大肠杆菌培养液的电导率值明显高于对照，在2h时最为显著，且随着作用时间的延长，培养液的电导率持续增加且均高于对照，表明白芨多糖能引起大肠杆菌细胞膜的通透性改变，使细胞膜透性增大导致细胞内的离子外渗（图2）。
图2 白芨多糖对大肠杆菌细胞膜通透性的影响
图3 白芨多糖对大肠杆菌细胞壁通透性的影响
2.4 白芨多糖对大肠杆菌细胞壁通透性的影响碱性磷酸酶存在于细菌细胞壁与细胞膜之间，正常情况下该酶不能透过细胞壁渗透到细胞外。在大肠杆菌培养液中添加白芨多糖后，菌液的碱性磷酸酶含量呈现先升后降趋势，在培养2h时达到最大值，以后呈下降趋势，但均高于对照，说明白芨多糖能够破坏细菌细胞壁的完整性，在短时间内造成细菌细胞壁通透性增加（图3）。
2.5 白芨多糖对大肠杆菌培养液中蛋白质浓度的影响 在大肠杆菌培养液中添加白芨多糖后，菌液的蛋白质含量在4h内一直呈上升趋势，且显著高于对照，说明白芨多糖引起了大肠杆菌胞内蛋白质的外渗。胞内蛋白的外渗进一步说明大肠杆菌细胞壁和细胞膜的通透性变大，细胞内的一些大分子物质可以渗出细胞。由于提取的白芨多糖没有进一步纯化，其中含有少量的蛋白质杂质，约为2.93μg/mL，样品组0h的A595值要高于对照（图4）。
图4 白芨多糖对大肠杆菌菌液蛋白质含量的影响
3 讨论
报道表明，很多植物的多糖具有抑菌作用，其作用浓度为1%～25mg/mL[7-10]，其中葛根多糖和大豆多糖对大肠杆菌的最小抑菌浓度均为8mg/mL。本实验据此设计了5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL4种多糖浓度，考察白芨多糖对常见的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及革兰氏阴性菌大肠杆菌、变形杆菌的作用效果，结果表明，5mg/mL的白芨多糖无抑菌效果，较高浓度即20mg/mL多糖对4种菌具有较强的抑制作用。白芨多糖的有效抑菌浓度偏高，并显著高于茶多酚[14]、蒲公英黄酮[15]等其他类型的次生物质。
药物的抑菌机制包括干扰细菌细胞壁的合成、抑制细菌核酸、蛋白质的合成及损伤细菌的细胞膜等。本实验表明，白芨多糖能改变大肠杆菌细胞壁和细胞膜的通透性，使其通透性增大，使细胞代谢发生紊乱而抑制其生长。电导率、碱性磷酸酶、胞外蛋白含量的变化规律与已有的研究基本一致[12-15]，在时间节点上略有不同。电导率的对照组2h时菌液的电导值下降，可能是由大肠杆菌吸收利用培养液中的NaCl引起，实验组大肠杆菌在利用NaCl时胞内离子有外渗，因此没有出现电导值的显著变化。白芨多糖是否存在其他的抑菌机制有待进一步研究，多糖的不同组分是否存在功能上的差异也需要进一步实验观察。
参考文献
[1]任华忠，何毓敏，杨丽.白及化学成分其药理活性研究进展[J].亚太传统医药，2009，5（2）：134-139.
[2]悦随士，田河林，李丽鸣，等.白芨甘露聚糖胶浆治疗上消化道出血的临床观察[J].中国现代医学杂志，2007，17（19）：2375-2377.
[3]Sunr S，Chen Xh，Cheng T M，et al.Some factors of BletillaStriata in woundhealing[J].Chinese journal clinicalrehabilitation，2003，7（29）：3927-3929.
[4]武桂娟，苏晓悦，夏学丽，等.白芨多糖对大鼠应激性胃溃疡影响的实验观察[J].中医药信息，2011，28（3）：43-45.
[5]Michinori K，Noriko S，Miho Y，et al.Application studies ofrhizomaBletillae（rhizomes of Bletillastriata）on atopic dermatitis[J].Nature medicine，2003，57（2）：55-60.
[6]陈玉，张晓芳，朱剑东.中药白芨抑制变形链球菌的实验研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2007，17（8）：452-454.
[7]李瑜，周玉，江冠民，等.枸杞多糖与黄芪多糖抑菌活性的研究[J].现代生物医学进展，2012，12（26）：5061-5063.
[8]杨长友.葛根多糖抑菌活性的测定[J].宁德师专学报（自然科学版），2011，2（2）：130-133.
[9]田龙. 水溶性大豆多糖的抑菌活性研究[J].中国油脂，2008，33（12）：64-66.
[10]蔡娟，黄敏桃，黄云峰，等.苦丁茶多糖活性成分动态累积及其抑菌活性[J].食品科学，2014，35（9）：43-47.
[11]韩丹，王艳萍，毕亚静，等.白芨多糖提取方法的优选及其理化性质研究[J].药学实践杂志，2013，31（1）：35-37.
[12]侯伟峰，谢晶，蓝蔚青，等.植酸对大肠杆菌抑茵机理的研究[J].江苏农业学报，2012，28（2）：443-447.
[13]周先汉，张秀喜，朱稀檩，等.蜂胶提取物抑菌活性及其抑菌机理的研究[J].食品科技，2009，34（5）：233-236.
[14]王晓英.蒲公英总黄酮对假单胞菌抑菌机理的探讨[J].食品研究与开发，2012，3（11）：18-22.
[15]钱丽红，陶妍，谢晶. 茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理[J].微生物学通报，2010，37（11）：1628-1633.
（责编：张长青）
