不同光质对龙眼胚性愈伤组织类黄酮含量的影响

董慧雪 周燕蓉 田奇琳 赖恭梯 林玉玲 赖钟雄

摘 要 以龙眼胚性愈伤组织为材料，研究不同继代培养基、培养时间和光质对龙眼胚性愈伤组织生长和类黄酮含量的影响。参照前人的研究结果，龙眼胚性愈伤组织分别在含2，4-D和AgNO3的继代培养基上交替继代培养，测定其在黑暗条件下15、20、25、30、35 d的类黄酮含量，分析其含量变化；在此基础上，分别于红光、蓝光、白光、黄光4种不同的光质下培养愈伤组织，研究不同光质对龙眼胚性愈伤组织类黄酮含量积累的影响。研究结果表明：在黑暗条件下，龙眼胚性愈伤组织在含AgNO3培养基上培养25 d时类黄酮含量最高为1.857 0%；在不同光质处理下，光质影响类黄酮含量从高到低依次为：蓝光（8.802 3%）>红光（4.659 4%）>白光（4.272 4%）>黄光（2.816 9%）>黑暗（1.857 0%）。

关键词 龙眼；胚性愈伤组织；光质；类黄酮

中图分类号 S677.2 文献标识码 A

龙眼（Dimocarpus longan Lour.）又名桂圆，属于无患子科（Sapindaceae）龙眼属（Dimocarpus）。龙眼的果实既可鲜吃又可作为药用，其果实味道甘甜，性温顺，还具有良好的滋养补益作用，可以有效改善因气血不足、心脾亏损而引起的眩晕、健忘、失眠等症状[1-2]。福建属于亚热带地区，适宜龙眼生长，为世界上主要的龙眼主产区之一。类黄酮（Flavonoids）是许多食源性植物中重要的一类次生代谢产物，它主要以自由态（黄酮苷元）或结合态（黄酮苷）的形式存在于植物体内。田景梅等[3-4]研究表明黄酮类成份不仅具有抗心血管疾病的作用还可以显著抗氧化，并且在龙眼中的含量很高，可为研究心脑血管系统疾病提供帮助。

目前对龙眼类黄酮含量的研究所选用的材料主要集中在龙眼壳、龙眼核、龙眼叶和龙眼花上[5-8]，而对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量的研究尚未见报道。近年来，生物制药的发展趋向于利用细胞组织培养方法生产植物次生物质，对龙眼胚性愈伤组织进行组织培养，能在短时间内获取大量材料[9]。在本实验室赖钟雄[9]研究得到的两种培养基的基础上，通过对两种不同的培养基上的龙眼胚性愈伤组织类黄酮含量的对比，筛选出类黄酮含量最高的生长时期；此外，植物的光合特性、品质、生长发育及次生代谢产物的形成还受到光质的影响[10]，而且不同光质的生物学效应不同，不同波长的光对同一种次生代谢产物的积累量影响不同[11]。因此在筛选出促进龙眼胚性愈伤组织类黄酮含量累积的培养基的基础上，进一步探索龙眼胚性愈伤组织类黄酮积累的适宜光质条件，研究结果为进一步提高龙眼胚性愈伤组织内类黄酮有效产量、优化培养条件提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 龙眼胚性愈伤组织 由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供的龙眼‘红核子胚性愈伤组织交替继代于两种不同的培养基上（培养基A： MS+20 g蔗糖+6 g琼脂+1.0 mg/L 2，4-D，以下简称2，4-D培养基；培养基B： MS+20 g蔗糖+6 g琼脂+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+5 mg/L AgNO3，以下简称AgNO3培养基）[9]。

1.1.2 试验仪器与试剂 753型分光光度计，电热鼓风烘干箱，恒温水浴锅（上海凯勒电子设备厂），电子分析天平（上海天平仪器厂），芦丁（维生素P）标准品、质量分数5%NaNO2、质量分数10%Al（NO3）3、1 mol/L NaOH、无水乙醇等。

1.2 方法

1.2.1 材料处理 每瓶接种4块大小均匀的龙眼胚性愈伤组织，直径2～4 mm，置于温度（25±2）℃，黑暗条件下培养。分别在15、20、25、30和35 d时测定类黄酮含量，在筛选出类黄酮含量积累的最佳时期和最佳培养基的基础上，进一步进行不同光质处理并测定其类黄酮含量，即分别用蓝光、红光、白光、黄光每天光照 12 h，每个处理10瓶，3次重复。

1.2.2 标准曲线的绘制 120 ℃干燥恒重的芦丁，准确称取5.0 mg，用体积分数60%微热乙醇定容至50 mL，混合均匀得质量浓度为0.1 mg/mL的标准应用液。精密吸取其0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只试管中，分别加入体积分数30%的乙醇至5 mL，然后再各自加质量分数5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min。加10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min。加1 moL/L NaOH溶液4 mL，加水0.4 mL，摇匀，放置10～15 min。每管不同质量浓度的芦丁标准品溶液总体积都为10 mL，于510 nm处测定光谱吸收值α，3次重复，取平均值，以吸光值对浓度用最小二乘法得回归方程、相关系数。

1.2.3 样品提取 参考比较孔晓龙等[13-16]的类黄酮提取方法，本试验采用乙醇浸泡提取法提取类黄酮含量。将龙眼胚性愈伤组织从培养瓶内取出，用两层滤纸包着放到电热鼓风烘干箱干燥烘干，并精确称取龙眼胚性愈伤组织干燥恒重样品0.5 g，秤取3份，分别用体积分数80%乙醇10 mL于水浴锅75 ℃浸泡提取2次，每次浸泡提取2 h。过滤，待滤液冷却后用体积分数80%乙醇溶液定容至50 mL。

1.2.4 提取物含量的测定 分别吸取样液5 mL 3份加入3支具塞试管中，各加质量分数5% NaNO2的溶液0.3 mL，摇匀。加质量分数10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min。加1 moL/L NaOH溶液4 mL， 加水0.4 mL， 摇匀， 放置5 min。 空白对照为体积分数80%的乙醇试剂，于510 nm波长处测定光谱吸收比，根据标准曲线计算出样液中类黄酮的含量。

1.2.5 类黄酮含量计算公式 光谱吸收比α=1.368 1C+0.008 2；样品中的类黄酮质量分数=（ρV1/WV2）×10-1；式中ρ为样液类黄酮的质量浓度分数；V1为抽提定容体积；V2为提取物含量测定取用样液体积；W为称样质量。

1.3 数据统计分析

用Excel和SPSS19.0等软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以浓度（C）为横坐标，光谱吸收比（α）为纵坐标，进行线性回归绘图，绘制标准曲线图，结果如图1。

回归方程为α=1.368 1C+0.008 2，其线性范围为0～0.5 mg/mL，相关系数为r2=0.999 4。所得标准曲线符合试验要求，能较准确的读出相应浓度。

2.2 2，4-D培养基和AgNO3培养基及不同时期对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量的影响

不同继代培养基培养的龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量的动态变化有明显差异，如图2所示。在AgNO3培养基继代培养过程中，在10到25 d时类黄酮的含量明显上升，并在培养第25天达到峰值，类黄酮质量分数为1.857 0%；25～35 d类黄酮的含量开始逐渐下降。2，4-D培养基培养的愈伤组织类黄酮含量虽然在15～20 d有所下降但整体呈上升趋势。

总体比较，在35 d的培养周期内，2，4-D培养基培养下的类黄酮积累量始终没有AgNO3培养基培养下的高。具体来说，10～25 d类黄酮含量在两种培养基上的差值越来越大，而在25～35 d的差值则越来越小。

2.3 不同光质处理下龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量的变化

在2.2的基础上，利用AgNO3培养基结合不同光质处理，25 d时龙眼胚性愈伤组织中的类黄酮含量如图3所示。结果表明：4种光质都有促进类黄酮含量增加的作用，其中蓝光最为明显，其类黄酮含量为8.802 3%，红光和白光处理下类黄酮含量相差并不明显，分别为4.659 4%和4.272 4%；对照黑暗的含量最低。不同光质下，龙眼胚性愈伤组织中类黄酮的含量的高低顺序为：蓝光（8.802 3%）>红光（4.659 4%）>白光（4.272 4%）>黄光（2.816 9%）>黑暗（1.857 0%）。

运用SPSS软件对所得数据进行方差在α=0.01水平上处理。结果表明材料在黑暗条件下培养时类黄酮的积累量和4种不同光质处理下的类黄酮积累量有显著性差异（p<0.05），其中，除了和黄光是差异显著（0.01

3 讨论与结论

3.1 AgNO3促进龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量的积累

本试验首先在2，4-D培养基和AgNO3培养基上筛选出龙眼胚性愈伤组织类黄酮含量高的培养基，结果表明在AgNO3培养基上培养龙眼胚性愈伤组织，类黄酮含量在25 d达到峰值，而2，4-D培养基上的类黄酮含量在培养后期出现逐渐升高的趋势，但最终没有超过在含AgNO3培养基上类黄酮的含量。根据叶炜[16]的研究，AgNO3培养基促使类黄酮含量显著上升的原因可能是因为AgNO3能够抑制乙烯的形成和其生理效应以及维持胚性愈伤组织状态，这一结果也与张真[17]的研究一致。而到25 d之后，可能是由于Ag+对胚性愈伤组织的持续胁迫作用，也可能是衰老引起的类黄酮含量下降，具体原因还有待于进一步探讨。而在含2，4-D培养基上的类黄酮含量在培养后期出现逐渐升高的趋势，这一现象与王文星[18]的研究一致，含2，4-D培养基有利于细胞黄酮的积累，由于工厂化要求在短时间内生产类黄酮，且后期培养基的营养物质已经快消耗完，故没有继续培养的价值。

3.2 蓝光处理最有利于龙眼胚性愈伤组织类黄酮的积累

研究表明光质影响龙眼胚性愈伤组织中类黄酮的含量的积累。以黑暗培养为对照，愈伤组织中类黄酮含量的积累，在光照条件下有明显的促进作用，不同光质对黄酮含量的积累能力大小依次为：蓝光>红光>白光>黄光>黑暗。在这4种光质处理下，蓝光最有利于龙眼胚性愈伤组织中类黄酮的积累，这与前人[19-21]在番茄、黄瓜中的研究是一致的。这可能是因为红光有利于可溶性糖和淀粉的积累，蓝光有利于蛋白质的合成，也就是植物自身的生长有差异，进而影响其体内类黄酮的积累。光质条件下的类黄酮的含量总是高于黑暗条件下的，谢宝东等[22]在光质对银杏叶片中黄酮含量影响的研究中也发现，光质不同黄酮的含量也显著不同，其中蓝光最有利于黄酮的含量的积累，与上述结论相一致。但是苏秀红等[23]研究表明绿光处理下冬凌草体内次生代谢产物的含量最大，红光处理下含量最小。本试验没有做绿光的处理，是本试验的不足之处，但仍然可以表明光质会影响类黄酮的积累量，光是植物体内次生代谢产物积累的重要影响因子。

综上所述，造成本试验结果的原因可能是：（1）光是植物生长的重要因子，在植物生长的过程中是一种重要的触发信号，因此其可以影响植物体中物质成分的积累[24]； （2）不同光质的峰值、辐照[25]以及波长不同，导致结果有所差异。本试验还存在一些局限性，比如试验设计得不全面，缺少绿光处理、用不同的光质交替照射等。本试验得出的结论可以为进一步研究光质对龙眼胚性愈伤组织中的次生代谢产物的积累提供科学依据。本实验之后，可以结合分子手段，研究具体的基因与类黄酮表达的关系。

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责任编辑：凌青根