淀粉芽孢杆菌HAB—7对18株植物病原真菌的抑制作用

刘文波++秦春秀++熊燕红++孙亮++林春花++缪卫国++郑服丛

摘 要 HAB-7是一株分離自豇豆根际土壤、具有较强抑菌作用的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。研究HAB-7对18株植物病原真菌及其发酵液粗提蛋白对植物病原的抑制作用，并测定其对番茄种子的促生作用。采用平板对峙法测定其对18株植物病原真菌的抑制活性，以橡胶树炭疽菌为指示菌，对其发酵上清液经60%、80%硫酸铵盐析获得的抗菌粗蛋白进行测试；并将HAB-7菌液稀释成6个浓度梯度，分别用来对番茄种子进行促生测试。结果显示：HAB-7对18株植物病原真菌的平均抑菌率为61.03%；其发酵上清液对橡胶树炭疽病菌的抑制率为56.80%，80%硫酸铵粗提蛋白对橡胶树炭疽病菌的抑制率为38.88%；10-4 CFU/mL的HAB-7菌液浓度促进了番茄种子胚根的伸长，长度比CK提高67.76%。HAB-7菌株对植物病原菌有较广谱的抑菌活性，其分泌的活性物质除了活性蛋白外，可能还有其他的活性物质，低浓度的HAB-7菌液能促进植物根系生长。本研究结果为后续研究其致病机理起到重要的作用。

关键词 解淀粉芽孢杆菌 ；抑菌活性 ；抑真菌蛋白 ；促生作用

中图分类号 S432 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.013

Analysis of Antifungal Activity of Bacillus amyloliquefaciens

HAB-7 Against 18 Phytopathogens

LIU Wenbo1） QIN Chunxiu1） XIONG Yanhong1）

SUN Liang2） LIN Chunhua1） MIU Weiguo1） ZHENG Fucong1）

（1 Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource/

College of Environment and Plant Protection，Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China；

2 Rubber Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737，China）

Abstract HAB-7 is a strain of Bacillus amyloliquefaciens isolated from the rhizosphere of Vigna unguiculata and has a strong inhibitory effect on phytopathogen. The strain HAB-7 was tested against 18 phytopathogenic fungi， and the crude protein extracted from the fermented HAB-7 was also tested against the phytopathogens to observe their inhibitory activities. The tomato seeds were treated with the strain HAB-7 to observe their germination and growth. Dural culture assay was used to test the antibacterial activity of HAB-7 against 18 plant pathogens. The antifungal crude protein extracted from the supernatant of fermented HAB-7 via precipitation of 60% or 80% ammonium sulfate was tested against the fungi of rubber anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides Penz. CGR-1 strain which was used as an indicator pathogen. The HAB-7 was diluted into 6 different concentrations， with which tomato seeds were treated to observe their germination and growth. The HAB-7 had an average inhibition rate of 61.03% against the 18 fungi； the supernatant of the fermented HAB-7 inhibited 56.80% of C. gloeosporioides； the crude protein of HAB-7 extracted via 80% ammonium sulfate precipitation also inhibited 38.88% of C. gloeosporioides. HAB-7 bacterial suspension at 1×104 CFU/mL improved the radical growth of the tomato seeds， 67.76% longer than the control. The HAB-7 displayed a broad-spectrum antagonistic activity， and its secreted antagonistic active substance contained antifungal protein and probably other active substances since HAB-7 bacterial liquid at a low concentration promoted plant root growth. This study plays an important role in follow-up study about its pathogenicity.

Keywords Bacillus amyloliquefaciens ； antifungal activity； antifungal protein； growth promotion

芽孢杆菌属（Bacillus spp）中，许多菌株能抑制植物病原菌，部分能促进植物生长[1]，有些菌株两种功能同时兼有。目前研究的芽孢杆菌中具有抑菌活性的主要有：枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、萎缩芽孢杆菌（B. atropheaus）、短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevs）等[2-6]。解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）在其生长过程中，可以产生抗菌蛋白、多肽或者一些低分子量的胞外代谢活性物质，能很好地抑制多种植物病原菌[7-8]，这些胞外物质在防治植物病害中起着重要的作用[9]，有些菌株除了能防治病害还能促进植物生长[10]。解淀粉芽孢杆菌在自然界中分布广，容易分离，大多分离自植物根系土壤附近[11]，对环境友好，且对人畜无毒，在环境中也不容易产生抗性[12-13]。由于分泌的抗菌蛋白对植物病原菌抑制机理特殊，不容易产生抗性，因而受到了国内外科研工作者的广泛关注[14]。

本实验室从豇豆根际土壤中分离筛选到对植物病原真菌有较强拮抗作用的细菌HAB-7菌株，初步研究HAB-7菌株及其代谢产物对植物病原真菌的抑制效果，为今后进一步研究其抗菌机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试细菌和真菌

供试细菌：HAB-7是本实验室从豇豆根际土壤中分离获得的一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

供试植物病原真菌（表1）为本实验室分离鉴定后保存，均经过单孢分离纯化备用。

1.1.2 供试培养基

PBA培养基；优化培养基（蔗糖30 g/L、葡萄糖10 g/L、酵母粉30 g/L、胰蛋白胨40 g/L）。往以上培养基加入18 g/L琼脂粉制即可作成固体培养基。其中PDA培养基用于培养植物病原真菌。

1.2 方法

1.2.1 HAB-7对18株植物病原真菌的拮抗作用

将供试植物病原真菌接种至PDA培养基平板上培养5 d；用打孔器在菌落边缘打直径0.4 cm的菌饼，将其接种到优化培养基平板（9 cm）中央，在菌饼4个角等距离接种HAB-7菌株，以不接HAB-7菌株的培养基为对照，均置于28℃恒温暗培养；待对照组菌落直径生长至整个培养皿（9 cm）的三分之二时，测量植物病原真菌菌落直径[15]，并测定HAB-7对供试病原真菌的拮抗作用。

抑制率=（对照组菌圈直径-处理组菌圈直径）/对照组菌圈直径×100%

1.2.2 HAB-7发酵上清液及发酵液粗蛋白对植物病原真菌的抑制作用

（1）HAB-7发酵上清液对橡胶树炭疽菌的抑制作用：将HAB-7接种到优化的液体培养基中，置于 28℃、200 r/min恒温培养箱中振荡培养72 h；取出后用高速冷冻离心机（eppendorf，5804R）以4℃、11 000 r/min离心30 min，取上清液；在超净工作台上，将上清液用细菌过滤器（Φ=0.22 μm）过滤除菌，把滤液存放在10 mL已灭菌的离心管中，于 4℃冰箱储存备用。在PDA 培养基平板上，用打孔器打4个成等边形的圆孔，在等边形中心处接上 1 个橡胶树炭疽菌菌饼，于28℃培养1 d后，将过滤除菌的胞外代谢物分别加到4个孔中，重复3次，将平板放入28℃恒温培养箱中培养，观察结果并测量[15]。

（2）HAB-7发酵液粗蛋白对橡胶树炭疽菌的抑制作用：将HAB-7接种于优化的液体培养基中，置于 28℃、200 r/min恒温培养箱中振荡培养72 h；取发酵液，用高速冷冻离心机以4℃、11 000 r/min离心，取发酵上清液100.0 mL，缓缓地向上清液中加入固体硫酸铵至60%饱和度，于4℃静止过夜；用高速冷冻离心机以4℃、11 000 r/min离心30 min，分别收集上清液和沉淀。向收集的上清液中继续加入固体硫酸铵，按照同样的方法调节至80%硫酸铵饱和度，收集沉淀蛋白；用适量的10.0 mmol/L、pH 7.0 的磷酸缓冲液（PBS）溶解，装入透析袋中，用相同浓度的PBS缓冲液透析过夜；用高速冷冻离心机以4℃、11 000 r/min离心透析液20 min，弃沉淀，将上清液过滤除菌，稀释成相同的浓度，接种方法同（1）。

1.2.3 HAB-7对番茄种子的促生作用

用75%酒精浸泡番茄种子15 s，再将种子用3%的NaClO消毒30 min，最后用无菌水漂洗6次；将HAB-7菌液分别稀释成0倍、10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍、10-5倍的菌悬液，分别取菌悬液和无菌水各5 mL，存放在10 mL的离心管中；分别将处理过的30粒番茄种子放入上述不同浓度的稀释液中，置于28℃恒温培养箱中培养12 h后取出，用无菌水清洗番茄种子6遍；将每个处理的番茄种子整齐地摆放在无菌的培养皿中，往培养皿中加入少量无菌水，每个培养皿放入6粒番茄种子，置于4℃冰箱72 h，再放入28℃光照培養箱光暗交替培养5 d。每个处理组3次重复，记录番茄种子根的长度[16-17]，以无菌水处理为对照（CK）。

2 结果与分析

2.1 抑菌作用测定

采用平板对峙法培养后，HAB-7对18株植物病原真菌的抑菌作用见图1。通过计算得出HAB-7对18株植物病原真菌的平均抑菌率为61.03%，并在0.05及0.01的水平上差异均显著，表明其对18株植物病原真菌的抑菌率存在差异，具有很好的抑菌潜力；对病原菌抑菌率最高的真菌是CGR-1（70.13%），最低的是COC-1（50.22%）（图2，表2）。同一种病原菌，来源不同，HAB-7对其抑制率也不相同，可能跟其抗药性及致病性有关。

2.2 HAB-7发酵上清液对病原真菌的影响

HAB-7发酵上清液对橡胶树炭疽病菌有明显的抑制作用（图3），经计算可知其抑制率为56.80%。初步推测HAB-7发酵上清液中可能含有某些活性物質（抗菌蛋白、多肽或者一些低分子量抗生素等），其抑菌活性跟HAB-7菌株直接作用相当，说明HAB-7菌株主要是靠分泌活性物质来抑制病原菌菌丝的生长。

2.3 HAB-7粗蛋白对橡胶树炭疽病菌的影响

HAB-7的80%硫酸铵粗提蛋白对橡胶树炭疽病的抑制率可达42.88%；60%硫酸铵粗提蛋白对橡胶树炭病菌无抑菌活性，在后期能被真菌菌丝全部覆盖住（图4）。在80%硫酸铵高浓度提取下，所得粗蛋白才对橡胶树炭疽病菌具有强烈的抑制效果，可知沉淀蛋白中含有抗菌活性蛋白，但含量可能少，其平均抑制率仅为38.88%，比其上清液的抑制率少17.92%。说明HAB-7菌株的发酵上清液中，除了抗菌蛋白，还有其他的活性物质抑制了植物病原真菌的生长。

2.4 HAB-7对番茄种子的促生作用

从图5可知，用10-4 CFU/mL的稀释菌液处理的番茄种子，其促生效果比以无菌水作对照（CK）的好。高浓度（10-2、10-1、原液）对番茄种子的胚根伸长具有一定的抑制作用，其它经稀释的菌液对番茄种子胚根都具有一定的伸长作用，尤其是在10-4 CFU/mL菌液浓度下，胚根长度与CK相比差异达到极显著水平，提高了67.76%（图6，表3），可见在此条件下，促生作用最为强烈，说明HAB-7的分泌物中存在对植物具有促生作用的物质。

3 讨论与结论

解淀粉芽孢杆菌在自然界中分布比较广，是一种重要的生防资源，对植物病原真菌或植物病原细菌能产生抑制作用[18]。本研究结果显示，HAB-7菌株对供试的18株植物病原真菌（主要是半知菌类）都有明显的抑制作用，平均抑菌率为61.03%，表明HAB-7菌株对半知菌类植物病原真菌具有抑制作用，且具有较强的次生代谢物产生能力，能产生多种抑菌物质[19]。解淀粉芽孢杆菌易于发酵， 且会将抑真菌蛋白分泌到胞外，抑真菌蛋白又具有性质稳定、水溶性等优点[20]。利用最优培养基（另文发表）培养HAB-7菌株，将其发酵上清液及80%硫酸铵沉淀蛋白与橡胶树炭疽病菌进行对峙培养，结果显示，上清液的抑制效果比粗提蛋白抑制效果提高了17.82%，表明发酵上清液中除了少量的抑菌蛋白，还有其他抑制病原菌的活性物质。芽孢杆菌的细胞膜上，有3种类型的蛋白泌出通道，能分泌出不同种类及大小的蛋白[21]；其分泌的抗菌蛋白和活性蛋白与环境和培养条件有关[22]。番茄种子发芽实验表明，高浓度的HAB-7能抑制番茄种子的萌发生长；在10-4 CFU/mL浓度下平均根长比CK长45.92 mm，促生效果明显。说明HAB-7菌株的次级代谢产物中含有一类植物激素类物质，可促进植物的生长，但是具体哪类物质还需进一步研究。

近年来，拮抗芽孢杆菌的筛选研究工作开展得较多，研究者也甚多[23]。目前的许多研究都仅仅停留在实验室阶段，真正分离纯化得到的活性物质尚达不到要求或稳定性较差[24]。虽然很多的芽孢杆菌已经获得农药登记许可证[25]，但是还有很多只能在实验室条件下才能表现出良好的抑菌活性，而在大田条件下，由于环境条件的改变，许多拮抗微生物不能很好地适应田间微环境，因此无法快速地生长繁殖，从而难以发挥抑菌作用。提高生防菌在田间叶片及根际的快速繁殖能力，是研究者需要考虑并解决的问题。

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① 基金项目：2015年海南省自然科学基金（No.20153131）；海南省产学研项目（No.CXY20140038）；国家农业产业技术体系建设（No.CARS-34-GW8）；农业部2013年热作农技推广与体系建设项目（No.13RZNJ-20）。

收稿日期：2016-10-12；责任编辑/林海妹；编辑部E-mail： rdnk@163.com。

② 刘文波（1978～），男，硕士，主要研究方向为从事热带植物病理，E-mail：saucher@163.com。

③ 通讯作者：缪卫国（1969～），男，博士，教授，主要研究方向为分子植物病理等，E-mail： weiguomiao1105@126.com；

郑服丛（1956～），男，教授，主要研究方向为植物病理学，E-mail： zhengfucong@126.com。