一株植物内生放线菌次级代谢产物的提取及抑菌活性研究

李增政　林滕　常永芳　周琴　刘俊林

【摘 要】通过从兰州百合中分离筛选得到的一株放线菌，且发现该菌株具有抑菌活性。本实验通过发酵来生产次级代谢产物，利用萃取的方法来提取次级代谢产物。用不同溶剂来溶解粗提物以及用菌体进行抑菌活性实验。最后得到该菌株的发酵产物且该产物对多种不同病原菌（如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等）具有较强的抑制作用。

【关键词】放线菌；次级代谢产物；抑菌活性；发酵；生理生化

0 前言

放线菌（Actinomycetes）是一类具有分支状菌丝体的高（G+C）mol%、革兰氏阳性细菌。在系统分类学中，分类学家将它分到细菌界、放线菌门、放线菌纲、放线菌目、放线菌科，放线菌属。目前已描述的放线菌至少有180个属，包括链霉菌属、诺卡氏菌属、放线菌属、小单孢菌属、链孢囊菌属、游动放线菌属等；其中研究最多的就是链霉菌属，因为该属主要用于生产抗生素，而且易于培养。因此，将除此属以外的其他属称作稀有放线菌。从放线菌中发现的生物活性物质至少有11000多种。前已发现的近万种抗生素，如各种抗癌剂、酶抑制剂、抗寄生虫剂、免疫抑制剂和农用杀虫剂等，约70%是由放线菌产生的，其中约三分之二的抗生素来源于陆生放线菌。放线菌与人们的生活息息相关，其代谢活性物质已广泛应用于现实生活中，如链霉素、万古霉素和阿奇霉素等被广泛应用于临床治疗，井冈霉素、庆丰霉素等成为农用抗生素。此外，还可用于烃类发酵、石油脱蜡、淄体转化、污水处理等。

次级代谢产物是指生物生长到一定阶段后通过次级代谢合成的分子结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是该生物生长和繁殖所必需的小分子物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同种类的生物所产生的次级代谢产物不相同，它们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。由于次级代谢产物大多具有生物活性，因此具有很大研究价值。

微生物在稳定期活菌数目达到高峰期，细胞内大量积累代谢产物，特别是次级代谢产物。有机物被生物体氧化降解成氧化产物并释放能量的过程统称为生物氧化。微生物生理学把生物氧化区分为呼吸和发酵，呼吸又可进一步区分为有氧呼吸和无氧呼吸。因此，发酵是生物氧化的一种方式。

发酵是这样一种生物氧化方式：在没有外源最终电子受体的条件下，化能异养型微生物细胞对能源有机化合物的氧化与内源的（已经经过该细胞代谢的）有机化合物的还原相耦合，一般并不发生经包含细胞色素等的电子传递链上的电子传递和电子传递磷酸化，而是通过底物（激酶的底物）水平磷酸化来获得代谢能ATP；能源有机化合物释放的电子的一级电子载体NAD，以NADH的形式直接将电子交给内源的有机电子受体而再生成NAD，同时将后者还原成发酵产物（不完全氧化的产物）。

细胞中的NAD是有限的，如果作为一级电子载体的辅酶NAD不能得到再生，就不能被回用，有效的电子载体就会愈来愈少，脱氢反应就不能持续进行下去了。因此，辅酶NAD的再生是生物氧化（包括发酵）继续进行下去的必要条件。

该菌株是兰州百合的内生菌株，本实验通过采用组织悬液法处理植物组织然后分别接种于改良高氏I号、腐殖酸培养基等10种培养基，在改良高氏I号中分离纯化得到一株菌体为红色形态特征明显的放线菌菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 目标菌株

从兰州百合中分离所得的一株放线菌。

1.1.2 主要试剂和药品

75%乙醇溶液、10%的碳酸氢钠溶液、生理盐水、大量高温灭菌的蒸馏水、无水乙醇、无水乙酸乙酯、甘油、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钾、氯化钠、氯化钙、重铬酸钾、制霉菌素、放线菌酮、萘啶酮酸等。

1.1.3 主要器材及仪器

9cm培养皿、剪刀、镊子、酒精灯、酒精棉球、移液枪、枪头（蓝色、黄色）、超净工作台、恒温培养箱、PH计、蒸汽灭菌锅、摇床培养箱、1000ml锥形瓶、滤纸、打孔器、离心机、旋转蒸发仪、冷冻干燥机等。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基及抑菌剂的配制

改良高氏I号：可溶性淀粉20g；K2HPO4·3H2O，0.5g；MgSO4· 7H2O，0.5g；FeSO4·7H2O，0.01g；KNO31g；NaCl0.5g；Distilled water1000ml；琼脂18g。

抑菌剂：重铬酸钾（50μg/mL）、萘啶酮酸（20μg/mL）、放线菌酮（50μg/mL）、制霉菌素（50μg/mL）。

发酵种子培养基：可溶性淀粉15g、葡萄糖5g、黄豆粉10g、氯化钠1g、蛋白胨5g、酵母提取物5g、碳酸钙5g、蒸馏水1000ml，PH7。

发酵培养基：黄豆饼粉20g、酵母粉15g、葡萄糖10g、K2HPO41g、碳酸钙3g、氯化钠1g、蒸馏水1000mL，PH7.2左右。

1.2.2 放线菌的培养及目标菌株的分离纯化

将涂布后的平板，置于培养箱中培养，温度为23℃，时间为30d。在改良高氏I号固体培养基上发现一株菌体为红色且形态特征明显的放线菌。将该菌株从原平板上分离接种于新的改良高氏I号固体培养基上，得到纯培养平板。

1.2.3 发酵

从生长到对数期的平板中挑取一定数量的单个菌落接种于种子培养基中培养，种子培养基于摇床中160r/min培养温度26℃培养时间2d。种子培养基占发酵培养基的10%。

将活化两天以后的种子培养基接种于发酵培养基中，温度26℃ PH7.2置于160r/min摇床中发酵14d。

1.2.4 次级代谢产物的提取

将发酵液取出摇匀于4℃4000r离心10分钟，分离上清液和沉淀。上清液用乙酸乙酯按照1：1的比例进行萃取，萃取完全以后分离有机相，将有机相通过旋转蒸发得到粗提物，再将粗提物于冷冻干燥机中冷冻干燥得到粗提物干品（胞外产物）。沉淀于80%丙酮中浸泡并且用超声波破碎，然后于4℃4000r离心10分钟，分离上清液和沉淀。上清液用乙酸乙酯按照1：1的比例进行萃取，萃取完全以后分离有机相，将有机相旋转蒸发得到粗提物，再将粗提物于冷冻干燥机中冷冻干燥得到粗提物干品（胞内产物）。本试验主要以胞外产物为研究对象。

1.2.5 抑菌活性

表1 次级代谢产物对细菌的抑菌活性结果

注：滤纸片直径为10mm结果中的抑菌直径包括滤纸品直径，一号溶剂为无菌蒸馏水，二号溶剂为乙醇，三号溶剂为乙酸乙酯.在做抑菌活性实验时乙醇、乙酸乙酯已挥发，对照（未加粗提物的乙醇、乙酸乙酯）中也没有出现抑菌圈.抑菌活性实验用无菌滤纸片法来操作，将次级代谢产物（胞外产物）分别称取0.05g溶于1ml蒸馏水、乙醇、乙酸乙酯溶剂，每个溶剂做3个平行最后取平均值（表1）。

1.3 结论及分析

该植物内生放线菌的发酵产物粗品对腐生杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌（野生型）、金黄色葡萄球菌（ATCC）、粪肠球菌、β-丙酰均有不同抑制作用；在污染的平板中发现该菌株对青霉菌、黑曲霉具有明显的拮抗作用。说明应用本实验中的方法发酵和提取发酵产物是可行的，而且该菌株产生的次级代谢产物对腐生杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌（野生型）、金黄色葡萄球菌（ATCC）、粪肠球菌、β-丙酰这些病原菌具有抑制作用。

所得产物在水、乙醇、乙酸乙酯三种溶剂中具有不同的溶解度，从整体的抑菌效果上来看溶解于乙酸乙酯的效果是最好的，乙醇次之，水最弱，当然不同的菌还是有差异例如大肠杆菌，造成这种现象可能是发酵产物中具有生物活性的物质有多种，这些物质对不同的菌有不同的抑制作用并且这些物质对溶剂的选择具有一定的条件性。

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[责任编辑：王楠]