甘蔗醋高产菌株的筛选及鉴定

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(1.广东轻工职业技术学院，广州 510300；2.五华县溢群酒业有限公司，梅州 514400；3.广州甘蔗糖业研究所，广州 510316)

近年来，食醋酿造朝着原料多样化、产品功能化及多元化的趋势发展[1]。果醋具有特殊风味以及保健功效[2-3]，逐渐占有食醋市场的重要份额。酿醋菌种是酿醋工业的关键因素，直接影响到生产成本和产品品质，国内外研究者在酿醋菌种选育方面已积累了丰富成果，例如，沪酿1.01和中科AS1.41是我国食醋工业应用已久的主要菌种[4-7]。然而，由于果醋原料繁多，果醋风味和酿造工艺等方面可能对酿醋菌种有更高的要求，促使了一些研究者对果醋菌种开展选育工作[8-10]。

与其它果醋酿造原料相比，甘蔗具有资源丰富、风味独特、富含糖分及其它营养成分等优点，是酿醋的良好原料。国内研究人员已开展了一些关于甘蔗醋发酵工艺的研究，但仍没有甘蔗醋酿造菌种筛选的报道。本实验以自然发酵的甘蔗渣为筛选材料，对酿醋的高产菌株进行筛选与鉴定，为甘蔗醋酿造提供优良的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

自然发酵的甘蔗渣和甘蔗汁 五华县酒业有限公司；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC31143 中国工业微生物菌种保藏管理中心；DNA提取试剂盒、16S rDNA的扩增引物以及PCR扩增试剂等 深圳华大基因科技服务公司；其它试剂 均为市售；富集培养基[11]葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，KH2PO42g/L，MgSO40.5g/L，调节pH5.0，121℃灭菌20min，冷却至70℃加入3%无水乙醇；分离平板培养基[12]在富集培养基的组成基础上，另加入琼脂20g/L和CaCO320g/L；CaCO3需预先进行干热灭菌(160℃、30min)，与无水乙醇同时添加，尽量使之在培养基中均匀分布；斜面保藏培养基[12]组成同分离平板培养基。

SHZ-82A型恒温水浴振荡器 江苏省太仓医疗器械厂；KDC-210HR高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；LC-10AD高效液相色谱仪 日本岛津公司；A200基因扩增仪 杭州朗基科学仪器有限公司；RDY-SP1Z核酸电泳仪 北京荣阳经典科技有限公司；GI-1凝胶成像系统 通宝达成科技(北京)有限公司；S-3000N扫描电镜 日本日立公司。

1.2 菌株富集培养及分离纯化

将10g自然发酵的甘蔗渣加入100mL富集培养基中，置于30℃、150r/min的条件下进行振荡培养24h；然后，吸取10mL培养液转接入90mL新鲜的富集培养基，于相同条件下培养。如此转接2次后，将培养液稀释涂布在分离平板培养基上，于30℃培养48h，用竹签挑取周围具有较大的、透明圈清晰的菌落，接入斜面保藏培养基，经培养24h，置于4℃保藏，备用。

1.3 产酸发酵筛选

参照文献提供的方法[13]，配制产酸发酵培养基。用蔗糖调节甘蔗汁糖度至160g/L，接入酿酒酵母CICC31143，置于30℃发酵至酒精度不再上升(残留还原糖2.0g/L以下)，用无菌水调节酒精度至6%(v/v)，加入无菌的酵母膏5g/L，并用无菌的NaOH溶液调节pH5.0，即得产酸发酵培养基。

将从分离平板挑取所得菌株的斜面菌种接入富集培养基，置于30℃、150r/min的条件下振荡培养24h，作为种子液。按10%的接种量，将种子液接入产酸发酵培养基，于30℃、150r/min下进行发酵，至醋酸浓度不上升时结束。检测发酵液的醋酸含量，根据产酸量筛选优良菌株。

1.4 耐酒精特性筛选

采用无水乙醇或无菌水调节产酸发酵培养基的酒精至不同浓度，分别接入10%的种子液，于30℃、150r/min下进行发酵，至醋酸浓度不上升时结束。检测发酵液的醋酸含量，计算酒精转化率，根据酒精转化率筛选优良菌株。酒精转化率的计算如下式：

酒精转化率(%)=发酵液中醋酸含量(g/L)/发酵液中初始酒精含量(g/L)×100

1.5 传代稳定性筛选

将上述筛选所得优良菌株的斜面菌种转接至新鲜斜面，置于30℃培养24h，再置于4℃保藏2周，然后进行第二次转接及保藏，如此转接10次。同时，每次转接的斜面菌种都用于产酸试验。检测发酵液的醋酸含量，比较各菌株的传代稳定性，从而优选菌株。

1.6 优选菌株的鉴定

参照文献的革兰氏染色显微镜观察法和扫描电镜观察法[14]，鉴定菌种形态特征；参照文献提供的方法[15-16]，鉴定菌种的生理生化特征；参照文献提供的16S rDNA鉴定方法[17]，鉴定菌种的同源性。

在16S rDNA鉴定中，引物1和引物2分别采用5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′；反应体系(50μL)为：10×Taq buffer 5.0μL，dNTP 1.0μL，模板 1.0μL，引物1和引物2各1.0μL，Taq酶0.5μL，ddH2O 39.5μL；PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物经琼脂凝胶电泳后，送至深圳华大基因科技服务公司测序，将获得的序列在GenBank中进行同源性检索，并采用MEGA5.1软件以Neighbor-joining法构建系统发育树。

1.7 测定方法

采用Lane-Eynon法[18]，测定还原糖含量；按国家标准GB/T10345-2007，采用蒸馏法和酒精计法的结合方法[19]，测定乙醇含量；采用高效液相色谱法[20-21]，测定发酵液中的醋酸含量，其测定条件为：日本岛津高效液相色谱仪LC-10AD，色谱柱Hypersil C18(4.6mm×150mm，5μm)，移动相为0.002mol/L的硫酸溶液，流速为1.0mL/min，进样10μL，检测波长210nm。

在样品检测前，预先精密配制0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.50g/L的乙酸标准溶液，经0.22μm滤膜过滤，按上述条件进行测定，采用外标法，以标准溶液的乙酸含量(x)和峰面积(y)绘制标准曲线，发酵液经10000r/min离心20min，取清液，经适当稀释以及0.22μm滤膜过滤，按上述条件进行测定，再根据标准曲线方程计算醋酸含量。

2 结果与分析

2.1 产酸发酵筛选

本实验高效液相色谱法所用标准曲线方程：y=32784.12x+648.36(相关系数R2=0.9996)，其中x为标准溶液的乙酸含量，y为峰面积。从分离平板上挑取到116株菌株，经过产酸发酵试验，其中产酸量居前列的10株菌的发酵结果如图1所示。由图1看出，10株菌产酸量分布在32.8～41.8g/L的范围内，产酸量的排序为：C22>C63>C34>C08>C75>C20>C16>C78>C03>C41。其中，菌株C22、C63、C34和C08的产酸量均超过40g/L，其中菌株C22的醋酸产量达41.8g/L，故以上菌株均优选为进一步筛选的对象。

图1 10株菌的产酸发酵结果 Fig.1 Acetic acid production of 10 strains

2.2 耐酒精性筛选

在不同起始酒精度的培养基中，菌株C22、C63、C34和C08的酒精转化率如图2所示。由图2看出，起始酒精度对醋酸菌的发酵作用有一定的影响，随起始酒精度的增加，4株菌的酒精转化率均呈下降趋势。各个酒精度下的酒精转化率可以反映出菌株的耐酒精特性，尤其在较高酒精度的条件下，各菌株的酒精转化率表现出较明显的差距。结果表明，4株菌耐酒精性的排序为：C22>C34>C63>C08。其中，菌株C22在起始酒精度12%(v/v)下仍具有较强的发酵作用，其醋酸产量为62.2g/L，转化率达65.7%。

图2 不同酒精度下的酒精转化率 Fig.2 Result of alcohol conversion rate on different ethanol degree

2.3 传代稳定性筛选

经过10次传代，4株菌在起始酒精度6%(v/v)的培养基中的发酵结果如图3所示。菌株C22、C63、C34和C08产酸的波动范围分别为：40.6～42.4g/L、39.5～41.2g/L、39.4～41.0g/L和39.2～40.8g/L，10次传代的产酸水平差距不大，表明各菌株具有良好的传代稳定性。同时，在各次传代过程中，菌株C22产酸能力居于首位，故被确认为最终优选的菌株。

图3 不同传代次数的醋酸产量 Fig.3 Acetic acid production of different passage times

2.4 优选菌株的鉴定

菌株C22的普通显微镜照片(16×100倍)和扫描电镜照片(×12000倍)分别如图4和图5所示。菌体经革兰氏染色呈阴性反应，形态呈短杆状、单个或成对排列，菌体大小为(0.6～0.8)μm ×(1.6～2.0)μm。菌株C22的生理生化特征试验结果见表1，根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)和《常见细菌系统鉴定手册》的描述，初步鉴定菌株C22为醋酸杆菌属菌种。

图4 菌株C22在普通显微镜下的菌体形态 Fig.4 Cell morphology of strain C22 under ordinary microscope

菌株C22的16S rDNA的PCR扩增产物大小为1395bp，将此序列在GenBank数据库中检索以及进行BLAST比对，发现该序列与许多巴氏醋酸杆菌(Acetobacterpasteurium)的16S rDNA序列的同源性达到100%，采用Neighbor-joining法构建系统发育树，如图6所示，其中菌株C22与巴氏醋酸杆菌(登录号：AB753861)的亲缘关系最接近。将菌株C22的形态、生理生化等特征与16S rDNA鉴定结果结合起来，可最终确定菌株C22为巴氏醋酸杆菌(Acetobacterpasteurium)。

图5 菌株C22在扫描电镜下的菌体形态 Fig.5 Cell morphology of strain C22 under scanning electron microscope

表1 生理生化试验结果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain C22

3 结论

以自然发酵的甘蔗渣为筛选材料，采用分离平板、产酸试验、耐酒精性试验以及传代稳定性试验等方法，筛选获得具有产酸高、耐酒精性强、遗传稳定的菌株C22。菌株C22在12%(v/v)的酒精度下仍能够表现出较强的发酵作用，在起始酒精度为6%(v/v)和12%(v/v)的培养基中，菌株C22的醋酸产量分别为41.8g/L和62.2g/L。经过形态特征、生理生化特征以及16S rDNA等方面的分析，鉴定菌株C22为巴氏醋酸杆菌。为了使菌株C22在甘蔗醋或其它果醋的酿造领域得到应用，其发酵特性仍需进一步研究。

图6 菌株C22序列系统发育分析 Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain C22

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