基于蛋白组学的水果蛋白质提取方法

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(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

蛋白质组学是指在高通量水平上研究蛋白质的特征,包括表达、翻译后的修饰、互作等内容。所涉及的技术包括蛋白质提取、分离、鉴定以及生物信息学分析等,其中蛋白质的提取是重要的过程[1]。由于水果组织中蛋白含量极低,加之富含蛋白酶及存在大量干扰物质,为后续的分析带来了诸多困难[2-3]。因此,选择适宜的水果蛋白质提取方法对开展蛋白质组学的研究就显得十分必要。目前,基于蛋白组学的水果蛋白质提取的方法均借鉴于其他植物材料,主要包括四种,分别是酚抽提法、SDS法、裂解液法以及三氯乙酸-丙酮法。本文对这些方法的特点及应用两方面进行了综述,旨在推荐适宜的提取方法,为水果蛋白组学的研究提供参考。

1 提取方法

1.1 酚抽提法

此法源于Hurkman[4]等人对植物细胞膜蛋白的提取。操作过程是取冷冻的组织,加入含有Tris-饱和酚和提取缓冲液(蔗糖,Tris-HCl,乙二胺四乙酸(EDTA),KCl,β-巯基乙醇,苯甲基磺酰氟(PMSF))研磨,离心取酚相,剩余液体用Tris-饱和酚继续提取、离心收集酚相,加入醋酸铵的丙酮溶液离心,再用醋酸铵的丙酮溶液、丙酮、乙醇分别洗涤沉淀,冷冻干燥沉淀后获得蛋白。由于该法可以有效地除去盐离子、酚类、糖类和色素等大量干扰物质,加之酚是强的蛋白变性剂,可以使蛋白质变性析出[5],因此可获得纯度较高的蛋白质,但该法操作过程较为繁琐。

酚抽提法现已广泛应用于水果蛋白质的提取[6]。陈虎等[7]利用该法获得了南丰蜜桔果皮中的蛋白质,提取率较高,得到的蛋白呈乳白色,易溶解。卢丞文等[8]采用高浓度Tris抑制蛋白酶的活性,采用提取缓冲液(蔗糖,Tris-Hcl,EDTA,KCl,β-巯基乙醇,PMSF)进行两次提取,充分去除干扰物质,从粉红果番茄果实中得到了纯度较高的蛋白质。Deytieux等[9]对该法进行了改良,他们将收集完酚相后的粗蛋白置于醋酸铵-甲醇溶液中,-20℃过夜沉淀,之后再用乙酸铵-甲醇溶液、冷甲醇、冷乙醇分别洗涤,得到了纯度较好的葡萄果皮蛋白质。Negri等[10]运用该法建立了葡萄果实细胞壁蛋白的提取方法,蛋白得率较高。

表1 果实蛋白提取的四种方法的比较Table 1 Comparison of four protein extraction methods of fruit

1.2 三氯乙酸-丙酮法(TCA-丙酮法)

水果蛋白质提取的经典方法,源于Damerval[11]等对小麦幼苗蛋白的提取。操作过程是取冷冻的组织,加入TCA-丙酮研磨,离心得到蛋白质沉淀,用丙酮洗涤沉淀、离心,冷冻干燥沉淀。三氯乙酸和丙酮都是有效的蛋白沉淀剂,两者通常结合使用以除去果实组织中含有的大量的以各种形式存在的可溶性非蛋白干扰物质,主要包括多酚、萜类和有机酸等[12]。此法最大的缺点是沉淀不完全会造成蛋白质的损失以及沉淀后得到的蛋白质难溶于裂解液中,且得到的蛋白质纯度不高,其中含有较多的杂质[13],这些都为后续的研究带来困难,故其应用受到限制。因此,需在提取过程中加入EDTA和Triton X-100等除盐剂以及还原剂(二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇)和蛋白酶抑制剂PMSF等保持蛋白稳定性的试剂,然后再用TCA-丙酮沉淀,可以获得良好的提取效果[14]。

该法较适用于果皮中蛋白质的提取。邓贵明等[15]利用该法提取了柑橘果皮中的蛋白质,所得蛋白质量大且纯度高。杨爱珍等[16]用该法对桃果实硬核后期果皮中的蛋白进行了提取,获得了纯度高的蛋白质。钟凤林[17]利用改良的该法提取了琯溪蜜柚果实汁胞中的蛋白质,蛋白质得率较高。王一鸣[18]采用优化的该法提取了硬核期桃果皮中的蛋白质,得到了纯度较高的蛋白质。Jean[19]等用该法获得了得率较高的葡萄果皮蛋白质。

1.3 SDS法

此法的特点是在提取缓冲液中加入十二烷基磺酸钠(SDS)。操作过程是取冷冻的组织,加入含有SDS的提取液研磨,离心,加入丙酮形成沉淀,再离心,取沉淀用丙酮洗涤至无色,冷冻干燥沉淀后获得蛋白。该法往往与酚法或TCA-丙酮法相结合。经SDS优化后的酚法和TCA-丙酮法,蛋白质的得率及纯度明显提高。由于SDS是一种阴离子去垢剂,因此要通过多次洗涤蛋白沉淀去除[20]。SDS具有很高的蛋白质结合能力,尤其是在高温条件下(95℃)可提高与膜蛋白的亲和力,同时在细胞裂解和蛋白提取过程中可抑制酶的活力[21]。

马斌等[22]在酚抽提法的基础上,通过在提取液中加入SDS,获得了得率及纯度较高的枇杷果实蛋白质。Wang等[23]结合TCA-丙酮法和酚法,通过加入了SDS,建立了一种适于多种果实蛋白提取的方法,得率高,所含杂质较少。Song等[24]运用TCA-丙酮法、热SDS缓冲液提取结合TCA-丙酮沉淀提取了苹果和香蕉果实果皮及果肉中的蛋白质,对于苹果果皮来说,SDS法的蛋白得率最高,杂质最少。

1.4 裂解液法

也称为尿素-硫脲法,运用溶解蛋白质沉淀的裂解液直接提取蛋白质,其主要成分为尿素、硫脲、Tris-HCl、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、DTT等[25]。操作过程是取冷冻的果实组织,加入裂解液研磨。静置后离心,再加入丙酮静置过夜。次日离心,收集沉淀并用丙酮洗涤至无色,冷冻干燥沉淀。用该方法提取的蛋白质杂质少,但相对于前几种方法蛋白质得率低,所得的沉淀需反复洗涤去除裂解液。

郑诚乐等[26]利用该法提取得到的粗提物含量较高,经过沉淀、溶解后蛋白质得率高、杂质少。Barraclough等[27]利用该法结合丙酮沉淀提取了苹果、鳄梨、柠檬和桃等果实中的蛋白质,蛋白质得率及纯度均较高。

2 四种方法的比较

上述各种方法均有其各自的特点。李开拓等[28]比较了酚法和TCA-丙酮法提取荔枝果皮中总蛋白质的效果,酚法得到的蛋白质含量较高。金良[29]等认为酚法所得葡萄果实蛋白质纯度高于TCA-丙酮法。吴满成等[30]分别用酚法和TCA-丙酮法提取了牛奶子果实中的蛋白质,后者的蛋白得率略高于前者,但纯度低于前者。王卓等[31]比较了酚抽提法和TCA-丙酮法提取香蕉果实中总蛋白质的提取效果,前者所得蛋白质量大且纯度高。王清等[6]建立了适用于甜樱桃、桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实的蛋白提取方法,用酚抽提法提取的蛋白质数量明显多于TCA-丙酮法。Saravanan等[32]利用酚法、TCA-丙酮法及改良的TCA-丙酮法提取番茄、鳄梨、香蕉和橙等果实组织中的蛋白质,并比较了提取效果,发现酚法的蛋白得率总体上都高于其他两种方法,对于鳄梨、香蕉和橙子,TCA-丙酮法和改良的TCA-丙酮法蛋白质得率低且杂质较多,而酚法效果较好。Vincent等[33]对比了酚法、TCA-丙酮法、SDS法对葡萄果实蛋白质的提取效果,酚法在蛋白得率和2D电泳效果方面都优于SDS法和TCA-丙酮法。王海玲[34]等用改良的酚法、SDS法、尿素/硫脲法提取了桑葚中的蛋白质,无论是纯度还是得率均以酚法最好。Isaacson等[35]比较了酚法和TCA-丙酮法,认为酚法更适用于复杂的顽拗植物组织如成熟葡萄果粒、香蕉果实等的蛋白质提取。

3 结论

综上所述,四种提取方法各有其优劣。由于果实的种类和品种、部位以及成熟度不同,故在具体操作中还需对酚法的提取过程进行进一步的优化,如采用高浓度Tris-饱和酚、抑制蛋白酶的活性、增加提取次数或与其他方法结合。考虑到目前的提取方法普遍存在蛋白质中杂质偏多,以及提取液残留等问题,因此,除杂仍然是提取蛋白质中需要细化的内容。同时,还需要开发简单、快速而又有效的提取新方法。

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