色谱和电泳技术 在乳清蛋白分离检测中的应用

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(乳业生物技术国家重点实验室,光明乳业股份有限公司光明乳业研究院,上海 200436)

乳清蛋白是牛奶中重要的一类蛋白,其主要来源于干酪生产过程中排出的乳清。据统计,每生产1t的奶酪对应产生的乳清量即达9t,且新鲜乳清中含有约原料乳中一半的营养成分(主要是乳清蛋白和乳糖)。乳清蛋白中主要含有可溶性蛋白,包括β-乳球蛋白(β-Lg)、α-乳白蛋白(α-La)、免疫球蛋白(Ig)、牛血清白蛋白(BSA)等[1]。大量研究[2-6]已经表明:乳清中各类蛋白均具有一定的生物活性和功能(表1),所以建立各类乳清蛋白的检测和分离方法对于乳清的开发和利用起到关键作用。现阶段,无论是在乳清蛋白的检测还是分离方法上,色谱和电泳技术的应用非常广泛。其中,检测的技术主要包括:高效液相色谱、毛细管电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法;分离的技术主要包括:离子交换色谱、凝胶色谱和疏水作用色谱等方法。本文总结上述色谱和电泳技术在乳清蛋白中检测和分离方面的应用,为乳清工业化利用提供参考。

1 色谱和电泳技术

色谱法又称为层析法,其原理是利用不同物质在不同相态的选择性分配,以流动相对固定相中的混合物进行洗脱,混合物中不同物质由于物化性质的差异以不同的速度沿固定相移动,最终达到分离的效果。根据物质的分离机制,主要分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱和亲和色谱等类别。现阶段,色谱技术已经广泛应用于化工、医药、食品、环境等领域的检测和分离。

电泳法的基本原理是带电颗粒在外加电场的作用下,向相反电极移动,迁移过程中依据带电粒子的分子量和电性差异将物质彼此分离出来。1937年瑞典学者蒂塞利乌斯设计出了移动界面电泳仪,从马血清白蛋白中分离出三种球蛋白,并由此创建了电泳技术。根据工作原理的不同可以分为:移界电泳、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、毛细管电泳等。其中区带电泳和毛细管电泳技术在现代生物大分子的分析和检测中引用非常广泛,如测定核酸的琼脂糖凝胶电泳,分析蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以及和高效液相色谱技术具有同样应用前景的毛细管电泳技术。

表1 几种乳清蛋白的化学性质和生理功能Table 1 Chemical properties and physiological functions of whey protein

2 色谱和电泳技术在乳清蛋白检测中的应用

2.1 高效液相色谱技术

高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)技术是在气相色谱技术及理论的成熟发展之上演变的以液体为流动相并配有高压输液系统、分离色谱柱和检测系统的分析技术。现阶段,主要采用的是反相高效液相色谱技术,其特点是:固定相为非极性材料,流动相为极性物质,流动相的极性大于固定相,该技术普遍用于非极性和弱极性物质的分离。

常用于乳清蛋白组分分析的HPLC色谱柱是C4、C8和C18色谱柱[7-9],流动相均采用0.1%的三氟乙酸水溶液和0.1%的三氟乙酸乙腈溶液进行梯度洗脱,检测波长为214～220nm之间。李慧[8]在利用HPLC法测定乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白时采用C8色谱柱,流动相:A相为0.1%的三氟乙酸水溶液,B相为0.1%的三氟乙酸乙腈溶液,洗脱程序为:0～10min B相从20%到50%,11～20min B相从50%到80%,21～22min B相从80%到20%,流速为0.8mL/min,检测波长为215nm,柱温30℃。结果表明:该方法的出峰快,峰型尖锐且对称,最终α-乳白蛋白的出峰时间在14.6min左右,β-乳球蛋白的出峰时间在15.6min左右。但由于目前婴幼儿配方奶粉中的α-乳白蛋白在喷雾干燥过程中部分结构会发生改变,这就导致C18柱不能检测出所有的α-乳白蛋白。苏米亚[9]利用巯基乙醇作为还原剂对样品进行前处理,破坏蛋白质中的二硫键形成展开的单体结构,使用盐酸胍缓冲液作为溶解液和流动相,检测波长为280nm,目标物质20min内即出峰且分离效果较好,可用于婴幼儿配方奶粉产品质量的评价。

虽然高效液相色谱技术在乳清蛋白的分析过程中应用最广泛,但是通常用于HPLC色谱柱填料的直径为5μm,这在分离目标产物的时间上会花费较长时间[10]。近年来,超高效液相色谱技术(ultra high performance liquid chromatography,UHPLC)的应用能够弥补这一不足。UHPLC色谱柱填料的直径降低为5～1.7μm,固定相的粒径越小,理论塔板高度越小,柱效也就越高;同时,色谱填料的直径降低会增大比表面积,从而使峰容量增加,可分辨出更多的物质。除此之外,质谱(mass spectrometric,MS)技术的特殊选择性和对物质结构的进一步解析也使得其在蛋白质分析上起到重要的作用[11]。越来越多的研究也证实LC-MS的联合应用技术在蛋白质分析领域是一项非常有力的工具。Yiping Ren[12]采用UHPLC-MS联用技术同时测定了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量。流动相仍采用0.1%的三氟乙酸水溶液和0.1%的三氟乙酸乙腈溶液,分离柱为直径1.7μm的C18色谱柱。该方法不仅缩短了检测时间(6min内检测出来两种蛋白)同时增加了最低检测限度(最低检测限达到0.15～0.19μg/mL)。

2.2 毛细管电泳技术

毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)技术是一种以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,根据被分析物质的特性差异实现分离分析的技术。CE是继高效液相色谱之后又一重大分析分离技术。该技术具有分离效率高、操作简单、经济、微量分析等优点。目前,CE技术已经是生命科学等领域中一种常用的分析手段,广泛应用于蛋白质、氨基酸、无机离子和有机化合物的分析中。

近年来,研究人员关于毛细管电泳技术在乳制品中乳清蛋白(主要是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)的定量分析[13-17]作了深入研究。尹睿杰[13]利用pH为3的柠檬酸缓冲液为运行缓冲液,未涂层熔融石英毛细管为分离柱,分离电压为28kV的条件对牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白进行了定量分析。结果显示,两种蛋白的检出限分别为13.2、20.0μg/mL,线性范围分别为30～2940、50～4960μg/mL。宋宝花[14]通过对硼酸盐运行缓冲液的pH进行优化得出硼酸盐缓冲体系的pH为9.1时最合适,但此条件下,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白(A、B型)的分离效果不好,通过加入0.8g/L PEO(聚氧化乙烯)和25mmol/L HP-β-CD(羟丙基-β-环糊精)解决了蛋白在管壁的吸附问题,从而达到三种蛋白的有效分离。根据文献报道,乳清蛋白在pH为5.8～7.0[18]的条件下结构最为稳定,而上述研究中运行缓冲溶液均采用了极端pH,这可能导致被测蛋白组分的变性。因此赖心田[17]开发了一种在中性pH条件下的CE检测方法,该条件中运行缓冲液为60mmol/L的磷酸盐缓冲体系(pH 6.5),毛细管柱为未涂层型,分离电压为15kV,检测波长为214nm,该方法在15min内即将α-乳白蛋白和β-乳球蛋白(A、B型)这三种蛋白有效分离。

除了上述两种可用于乳清蛋白定性、定量分析的色谱和电泳技术外,聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)特别是Native-PAGE和SDS-PAGE技术在蛋白质的定性(分子量)和定量(根据条带亮度初步判断)分析上应用极为广泛。另外,结合电泳和色谱两种技术的毛细管电色谱(capillary electrochromatography,CEC)技术近年在多肽和蛋白质的分离和分析上表现出更佳的效果[19]。CEC是以电渗流为驱动力,同时在毛细管内填充或在内壁涂覆、键合或交联色谱固定相的一种微柱液相色谱技术。但CEC技术在乳清蛋白的检测分析上报道还很少,Rehder[20]利用DNA寡核苷酸形成的G-quartet结构用于毛细管固定相分离牛乳中的三种酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。结果表明,形成四面形的G-quartet结构对于上述蛋白的分离效果最好。

3 色谱和电泳技术在乳清蛋白分离中的应用

3.1 离子交换色谱技术

离子交换色谱(ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,以含有特定离子的溶液为流动相,利用流动相中的离子和离子交换剂上可交换的离子之间发生交换作用,根据不同离子间的交换能力不同,待分离的各种离子在离子交换剂中迁移的速度也不同,从而将混合液中不同离子进行分离的技术。所以,凡是在溶液中能够被电离的物质通常可以通过离子交换色谱法进行分离。离子交换剂按照其结合的离子基团的不同又分为阳离子交换剂和阴离子交换剂,每种离子又可分为强弱两型,根据被分离物质的性质不同选择。该技术不仅适用于无机离子的分离,也可用于有机物的分离,例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子,应用范围较广。

在报道的众多研究中,用于乳清蛋白分离的离子交换树脂的性质并没有统一的选择,这其中阴离子交换树脂[21-25]的应用比较多,阳离子交换树脂也有部分报道[21,26]。用于平衡离子交换色谱柱和洗脱目标物质的缓冲液通常选用pH不同的磷酸钠缓冲液(PBS缓冲液)和三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液),洗脱液中除了上述的缓冲液组分以外,通常加入梯度浓度的NaCl来增加洗脱液的离子强度,从而达到对目标产物的洗脱。Xiuyun Ye[21]利用强阴离子交换树脂QAE对乳清中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白进行分离。α-乳白蛋白通过0.05mol/L的Tris-HCl溶液(pH 8.5)中NaCl的浓度从0～0.15mol/L进行线性梯度洗脱得到,β-乳球蛋白B组分和A组分通过0.05mol/L的Tris-HCl溶液(pH 6.8)中NaCl的浓度从0.1～0.25mol/L进行线性梯度洗脱得到。同时他又利用强阳离子交换树脂SP从乳清中分离得到了乳过氧化物酶和乳铁蛋白。最终从1L的乳清蛋白中分离得到了1260mg的α-乳白蛋白、1290mg的β-乳球蛋白B组分和2280mg的β-乳球蛋白A组分。Maria[22]同样通过强阴离子交换树脂Mono Q 5/50 GL从浓缩乳清蛋白WPC80中分离出α-乳白蛋白和Ig的混合物、BSA、β-乳球蛋白A和B组分。在洗脱过程中,Maria同样采用的是Tris-HCl溶液,不同之处在于其浓度和pH分别为20mmol/L和6.3,通过控制NaCl的浓度从0～0.5mol/L进行梯度洗脱得到。

上述两种方法均是采用阴离子交换树脂作为分离介质,而Jose[26]通过弱阳离子交换树脂也同样从牛乳清中分离出了β-乳球蛋白。与上述预处理方法不同的是,Jose先利用50%的硫酸铵沉淀调酸处理过的乳清(磷酸调pH到3.0),上清去除,得到的沉淀再用pH 3.0的PBS溶液溶解。溶解液再用70%的硫酸铵溶液沉淀,沉淀去除,此时得到的上清溶液中β-乳球蛋白的纯度已经达到80%(SDS-PAGE分析)。最后一步经过弱阳离子交换树脂纯化,洗脱的过程只选用了pH为4.9的磷酸盐缓冲液,最终得到纯度达95%以上的β-乳球蛋白(SDS-PAGE分析)。

3.2 凝胶色谱技术

凝胶色谱(gel chromatography,GC)的分离原理:被分离的混合物在通过具有多孔网状结构的凝胶颗粒时,比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶而从凝胶颗粒之间的空隙间流动,所以被最先洗脱出来,而比凝胶孔径小的分子能不同程度地自由出入凝胶内外空隙,因而迁移的路径变长且速率变慢,最后被洗脱出来,因此,凝胶色谱又被称为分子排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC)。根据被分离的对象是水溶性化合物还是有机溶剂可溶物,凝胶色谱又可分为凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography,GFC)和凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography,GPC)。GFC一般用于分离可溶性的大分子,如多糖、蛋白类化合物,凝胶材料多是葡聚糖系列凝胶;GPC一般用于有机溶剂中可溶高聚物的分离,常用的凝胶材料多为交联聚苯乙烯凝胶。因此凝胶色谱技术的应用范围广,特别是在生物大分子领域,如蛋白质、肽、核酸等领域。

与离子交换色谱、高效液相色谱相比,凝胶色谱的流动相通常采用组分简单且pH中性的水溶液,对生物大分子如蛋白质比较温和。Yoshida[27]利用Sephacryl S-200柱从200mL乳清中先后分离到了408mg的β-乳球蛋白二聚体和98mg的α-乳白蛋白。Shalan[28]利用不同的凝胶填料(Sephacryl S-300和Fractogel TSK HW-55)从牛乳清中分离得到牛免疫球蛋白。但上述两个研究都是针对乳清中个别目标蛋白得到的分离方法且方法比较繁琐。Mong Liang[29]开发了一种较为方便的分离方法,从自制的乳清中分离到了五种组分,按照流出先后顺序分别为免疫球蛋白、牛血清白蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和糖巨肽。该方法所选用的凝胶色谱柱为Sephadex G-200,洗脱液是pH 7.2的Tris-HCl溶液。但由于β-乳球蛋白的量比较大,同时与α-乳白蛋白的分子量相近,导致α-乳白蛋白收集流出液中含有一定量的β-乳球蛋白,分离效果不好。Bayram[30]在利用Sephadex G-200凝胶色谱柱分离乳清蛋白时也发现:直接分离乳清得到的第二部分流出液中同样也是β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的混合液。通过对第二部分流出液进行胃蛋白酶处理后,利用SDS-PAGE检测发现胃蛋白酶处理后只剩下β-乳球蛋白。另外,先对乳清进行胰蛋白酶处理,然后再通过Sephadex G-200凝胶色谱柱分离得到的第二部分流出液中只含有α-乳白蛋白。由此可以得出结论:β-乳球蛋白能够耐受胃蛋白酶的水解作用,而α-乳白蛋白能够耐受胰蛋白酶的水解作用。

除了常用于乳清蛋白分离的离子交换色谱和凝胶色谱技术以外,置换色谱[31](displacement chromatography,DC)技术和疏水作用色谱[32](hydrophobic interaction chromatography,HIC)技术也有报道可以用于乳清蛋白组分的分离纯化。Roberto[31]对比不同条件下环形置换色谱对β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)的分离效果。实验过程采用的色谱柱为环形Macro-Prep Q 25柱,缓冲载体溶剂为20mmol/L、pH7.2的Tris-HCl溶液,所用置换剂为乙二醛亚硫酸氢钠(GBS)。结果表明:缓冲载体溶剂流速在0.1mL/min条件下分离效果比更高流速要好;GBS浓度对分离效果影响也较大,低浓度(100mmol/L)GBS也明显优于高浓度(140mmol/L或180mmol/L)条件。经过上述条件的优化,最终实现环形置换色谱对目标蛋白的分离。Zhang[32]通过不同疏水配体和洗脱液中硫酸铵浓度两个条件来优化疏水作用色谱,对人重组α-乳白蛋白(rHLA)和牛α-乳白蛋白(BLA)进行分离纯化。结果证实:苯基型疏水配体对目标物质吸附能力最弱,丁基和辛基疏水配体吸附能力相当,这个结论和Noppe[33]的研究结果相矛盾,推测可能原因是Noppe通过EDTA除去α-乳白蛋白中的钙离子。进一步研究表明:丁基疏水配体在硫酸铵浓度为0.8mol/L时两种α-乳白蛋白分离效果最好,rHLA回收率达85.2%,纯度达97.2%。虽然DC技术在分离目标物质上有较多优势(如上样量大,被分离组分之间界限清晰,所用溶剂量少等),但是置换剂和固定相的选择较为严格,成本较一般色谱技术高。HIC技术由于需要使用高离子浓度的盐溶液,对活性蛋白会有一定的影响且成本较高。因此这两项色谱技术的应用价值比IEC和GC技术要小。

从相关文献报道来看,用于乳清蛋白分离的方法主要集中在色谱领域的技术,电泳技术由于放大过程设备难以实现,所以应用多集中于分析检测方面。但是,少量目标乳清蛋白的分离同样可以通过电泳技术实现,如聚丙烯凝胶电泳目标条带的割胶回收,毛细管电泳特定时间段流出液的收集等。虽然在大规模应用生产过程中色谱技术明显占优势,但电泳技术在少量样品制备上仍具有回收率高、纯度高等优势。

4 展望

乳清蛋白是牛奶中一类具有多种生理活性的蛋白。虽然国外关于乳清蛋白的分离和检测技术已经发展了半个多世纪,但我国乳清再利用技术特别是乳清中重要蛋白的分离技术仍不成熟,这也是导致国内原制干酪至今没有形成规模化生产的主要受制因素。现阶段国内的研究内容多集中在乳清蛋白分析方法的建立,而关于乳清蛋白的分离技术的研究报道很少。我国未来乳制品消费模式中,奶酪产品是最具发展潜力的方向,特别是开发符合国人口味的中国特色奶酪,这必然会涉及到乳清再利用技术特别是工业化规模的分离技术。本文通过总结国外成熟的乳清蛋白分离和分析技术,为国内未来乳清处理提供借鉴。国外通常用于乳清蛋白分离的是色谱技术,包括离子交换色谱和凝胶色谱技术,虽然凝胶色谱技术操作过程快速简单,但对于分子量相近的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的分离效果较差,而离子交换色谱对这两种蛋白分离的效果比较好,所以通过这两种技术的结合可以有效分离乳清蛋白各组分。此外,色谱技术还可以和先进的膜分离技术相结合,以保证分离过程的简单性和温和性,是未来乳清蛋白甚至是各类生物大分子分离的重点方向。乳清蛋白的分析方法通常采用的是高效液相色谱和毛细管电泳技术,随着材料科学的不断进步,已经发展出结合这两者技术的新方法,即毛细管电色谱技术。虽然该技术在乳清蛋白检测上还不成熟,但凭借其优异的分离特性,未来在乳清蛋白的分析检测中具有重要的应用前景。

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