鱼卵肽钙复合物 对大鼠体内促钙吸收作用的研究

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(1.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003;2.日照职业技术学院水产学院,山东日照 267826)

钙是维持人体健康的重要矿物元素,在骨骼与牙齿的形成、神经递质释放、肌肉组成和心脏搏动调节等生理活动中发挥着重要作用。钙主要通过饮食摄入,尤其以牛奶或奶酪制品含钙量较高。食物中的植酸、草酸、饱和脂肪酸、膳食纤维等物质易与钙结合形成难溶物,不利于钙的吸收。缺钙可以导致骨质疏松、佝偻症等多种疾病的发生。

我国水产品产量位居世界第一,其中淡水鱼产量达到50%。目前全球水产品加工业每年约产生30%的副产物[1],其中很大的一部分是鱼卵。淡水鱼肌肉只占体重的30%～50%,副产物比例较大,尤其是卵巢部分,在繁殖季节最大可达体重10%～25.81%。水产加工副产物已经有大量的利用研究,如从鱼皮、鱼鳞中提取胶原[2],虾蟹壳中提取壳聚糖[3],从鱼类精巢中提取具有抑菌保鲜和生理活性等功能的鱼精蛋白[4],而关于鱼卵的利用研究则较少。

大量研究表明氨基酸或肽钙复合物具有抑制钙在肠道中沉淀,促进肠道对钙的吸收,增强钙生物利用率的功能。如Tsuchita[5]等报道称CPP-Ca能有效抑制老年去卵巢大鼠的骨质流失,Jung[6]等报道称鱼骨肽钙复合物能显著增强去卵巢大鼠的钙生物利用率,增强股骨钙含量、骨重、骨密度和骨强度,Choi[7]等研究表明卵黄磷酸肽钙复合物能有效促进大鼠的钙吸收和骨钙沉积,增强骨密度,韩樱[8]等研究表明蛋清肽钙复合物能显著增加大鼠股骨直径、重量、骨钙含量及骨密度,陈瑞仪[9]等证实氨基酸螯合钙能增加大鼠骨密度。

本文首次对鱼卵磷酸肽(EPP)的促钙吸收作用进行研究,并与碳酸钙、酪蛋白磷酸肽-钙复合物(CPP-Ca)进行比较,为鱼卵用于补钙产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验动物SPF级SD雄性大鼠 山东鲁抗医药股份有限公司,合格证号:SCXK(鲁)2008-002,体重80～90g;饲养房环境参数:温度(20±2)℃,湿度为60%±5%,12h昼夜交替。

氯仿、甲醇、硝酸、高氯酸、水合氯醛 国药集团化学试剂有限公司;酪蛋白磷酸肽CPP 青岛秀佰锐生物器材有限公司;Lunar Prodigy双能X线骨密度仪 美国GE公司;Zwick/Z005型电子万能实验机 德国Zwick公司;ACA-100 型电子天平 美国Denver仪器公司;AA320CRT型原子吸收分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;ADVIA 2400全自动生化分析仪 日本Siemens公司;TGL-16G-A高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;AL-104电子精密天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;游标卡尺 桂林广陆数字测控有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鲤鱼卵磷酸肽-钙复合物(EPP-Ca)的制备 参照前期实验结果[10],脱脂鱼卵粉用胰蛋白酶酶解(胰蛋白酶3%,底物浓度2.5%,pH8.0,49℃,12h)后,100℃ 加热5min 灭酶,于4℃、10000r/min条件下离心20min后取上清液过0.45μm微孔滤膜,滤液经喷雾干燥即得鱼卵磷酸肽(EPP)。将EPP与氯化钙进行钙结合反应(蛋白与钙盐质量比6∶1,pH6.0,50℃,30min)后,离心除去沉淀,上清液加入与等体积的无水乙醇,于10000r/min、4℃条件下离心5min收集沉淀,即为EPP-Ca粗品。EPP-Ca粗品用无水乙醇多次洗涤,除去未结合的蛋白和游离钙,用二硫腙和茚三酮检测滤液颜色(二硫腙检测显示红色,表明含有游离钙离子,绿色则无;茚三酮检测显示蓝紫色,表明存在未结合的蛋白,不显色则无),最终干燥得到EPP-Ca(蛋白含量87.2%,钙含量9.6%)。酪蛋白磷酸肽-钙复合物(CPP-Ca)的制备参照上述方法。

1.2.2 自制缺钙饲料和普通饲料 普通饲料和缺钙饲料参考AIN-93G方法配制(表1)。普通饲料钙含量为5000mg/kg饲料,低钙饲料钙含量为1000mg/kg饲料。

1.2.3 动物饲喂方式 大鼠适应性饲喂1周后,将65只SD大鼠称重、随机分成5组,每组13只(表2)。正常对照组一直饲喂普通饲料,低钙组一直饲喂低钙饲料;其余3组饲喂低钙饲料四周,在继续饲喂低钙饲料基础上,按照钙200mg/kg体重的剂量,分别灌胃碳酸钙、FSP-Ca和CPP-Ca四周。大鼠用不锈钢鼠笼喂养,鼠笼每周清洗、消毒,实验期间大鼠自由饮用去离子水。每周称一次体重,增重率为大鼠灌胃前后体重增长率。

1.2.4 血液生化指标测定 实验结束后,大鼠腹腔注射水合氯醛(0.3g·kg-1)将其麻醉,腹主动脉取血4mL,低温静止20min后,离心(4500r/min,10min,4℃)取血清,置全自动生化分析仪中检测血清中钙、磷和碱性磷酸酶含量。

表1 大鼠饲料配方Table 1 Diet formulated for rats

表2 大鼠分组及饲喂方式Table 2 Groups of rats and its feeding ways

1.2.5 钙表观吸收率 实验结束前三天将各组大鼠分别置代谢笼中,收集粪并将其于95℃烤箱中干燥,取出后置干燥器中冷却,称量干重后研成粉末,湿法消化后采用火焰原子吸收法测定其中钙含量。

1.2.6 大鼠股骨指标测定 将大鼠左侧股骨剥离干净,用电子天平称湿重,游标卡尺测定骨长度。用氯仿-甲醇(2∶1)混合液浸泡24h脱脂,烤箱95℃过夜后干法灰化,称重。灰分用火焰原子吸收法测钙含量。取大鼠右侧股骨,置于双能X线骨密度仪扫描台上,测定股骨中点密度,再置于电子万能实验机上进行测试,设定跨距20mm,加载速度1mm/min,测定最大载荷(ML)、弹性载荷和刚度。

2 结果与分析

2.1 EPP-Ca对大鼠生长及钙吸收的影响

表3 EPP-Ca对大鼠体重和钙吸收率的影响Table 3 Effect of EPP-Ca on body weight and calcium absorption ratio of rats

注:各列数据中上标不同的字母说明存在显著性差异,p<0.05。表4～表6同。

表5 EPP-Ca对股骨长度、重量、密度及骨钙的影响Table 5 Effects of EPP-Ca on femurs length,weight,bone mineral density and Ca content

由表3可知,缺钙模型组的增重率仅为16.52%,显著低于其余各组,说明缺钙已经导致大鼠营养不良,体重增长缓慢。三种补钙方式均能显著增加大鼠增重率,改善前期由于缺钙导致的营养不良状态。虽然三种补钙方式增重率不存在显著性差异,但EPP-Ca组和CPP-Ca组的增重率分别为25.53%和25.04%,更接近正常对照组的26.72%,而无机钙组的增重率为23.55%,显著低于正常对照组。除缺钙模型组的钙摄入量控制在10.13mg/d的低水平外,其余各组的钙摄入量均达到50mg/d且无显著性差异,使得各组可以在相同钙摄入水平上比较吸收率。EPP-Ca组和CPP-Ca组的粪钙分别为17.82%和17.06%,均显著低于正常对照组,而吸收率分别为65.28%和65.89%,均显著高于正常对照组,说明大鼠在缺钙状态下钙的吸收率将高于正常水平,以尽快改善体内钙不足的生理状况,这种现象在缺钙模型组得到有力证实。缺钙模型组的钙吸收率高达84.32%。何丽[11]、吕莹[12]的研究也表明大鼠在低钙摄入条件下,钙吸收率可达80%～90%。但这是由于钙摄入严重不足引起的,这种情况下的高吸收率对改善机体营养状况是没有意义的。EPP-Ca和CPP-Ca的补钙效果要显著优于无机钙,二者的钙吸收率是无机钙的2倍左右。两种肽钙复合物在促进大鼠增重率、降低粪钙和增加钙吸收率方面的作用均不存在显著性差异。

2.2 EPP-Ca对血液指标的影响

当机体内钙充足时,肠道吸收的钙通过血液在骨骼沉积,促进骨骼生长,增强骨密度和骨强度,血钙维持在正常水平。当机体缺钙,导致血钙降低,甲状旁腺激素(PTH)会动员骨钙释放入血,维持血钙稳定,同时骨中成骨细胞异常活跃,合成大量血清碱性磷酸酶(ALP)释放进入血液。由表4可知,缺钙模型组的血清钙仅为2.15mmol/L,显著低于其它各组,说明缺钙模型造模是成功的。虽然三种补钙方式均能有效维持正常血钙水平,但EPP-Ca和CPP-Ca的血钙水平分别达到2.58mmol/L和2.62mmol/L,显著高于无机钙,这与钙吸收率的结果相吻合,说明肽钙复合物态钙比无机态钙更能促进大鼠体内钙的吸收。各组之间血清磷不存在显著性差异,说明机体补充钙剂对血清磷无明显影响。缺钙模型组的ALP含量高达240.75U/L,显著高于其余4组,说明缺钙导致大鼠机体钙代谢出现了异常,而通过补充钙剂能有效维持机体对钙的需求,使血清碱性磷酸酶含量维持稳定。

表4 EPP-Ca对大鼠血钙、磷和碱性磷酸酶含量Table 4 Effect of EPP-Ca on Serum Ca,P and ALP of rats

2.3 EPP-Ca对大鼠骨骼生长的影响

由表5可知,各组的骨长度之间不存在显著性差异,说明补钙对股骨长度没有明显影响。对于缺钙大鼠来说,补钙能显著增加骨重量、骨密度和骨钙含量(p<0.05)。就骨重量来说,EPP-Ca组高达877.31mg,显著高于缺钙模型组,而三种补钙方式间不存在显著性差异,均能达到正常对照组的骨重量水平。就骨密度和骨钙含量而言,EPP-Ca组分别为0.22g/cm2和254.75mg/g,显著高于缺钙模型组和无机钙组,与CPP-Ca组相当,说明肽钙复合物能显著促进大鼠体内钙在骨中的沉积,使大鼠骨密度和骨钙含量迅速恢复到正常水平,且效果要优于无机钙,这与钙吸收率的结果相吻合。

骨生物力学是研究大鼠骨骼在外力作用下的力学特征和受力之后的生物学效应,目的是了解骨骼力学强度变化及在骨骼负荷时发生骨折的可能性。大鼠股骨生物力学指标也表明,EPP-Ca能显著增加缺钙大鼠股骨的最大载荷、弹性载荷和刚度,效果要显著优于无机钙,而且其弹性载荷和刚度显著高于正常对照组。

表6 大鼠股骨生物力学指标Table 6 Femur biomechanical indexes of rats

3 讨论

缺钙是全球性的营养问题,膳食结构不当以及特殊的生理阶段(如青少年、绝经后妇女、老年等)均会引起人体缺钙[13-14]。体内钙处于平衡状态,99%的钙存在于骨骼当中,其余1%处于牙齿、软骨组织、血液以及管外浆液中[15]。有效的钙制剂需要满足两个方面的要求,即高吸收率和高利用率[16]。

青少年体重增长率是衡量机体营养状况的综合指标,营养不良往往导致生长较缓。本实验中EPP-Ca能有效促进大鼠生长,增重率达25.53%,效果优于无机钙。

钙的吸收主要发生在小肠,小肠吸收的钙占总吸收钙的90%[17]。小肠近端主要以主动方式吸收,而远端以被动方式吸收。人体对钙的吸收率一般为30%～80%。当摄入钙不足时,钙主要在小肠近端被主动吸收,而当钙摄入充足时,钙主要在小肠远端被动扩散吸收[18]。小肠远端的碱性环境会导致钙聚集沉淀而无法被吸收。研究表明,CPP具有阻止钙在小肠远端中沉淀,从而促进钙的吸收[19]。本实验中EPP-Ca的吸收率均显著高于无机钙,说明EPP可能也是通过抑制钙在小肠远端的沉淀而促进钙的吸收。

长时间的缺钙会使骨钙得不到有效补充,导致骨钙丢失、骨密度下降、骨强度下降等,严重时导致骨质疏松症、佝偻病。本实验中EPP-Ca能维持正常的血钙水平,显著增加骨重、骨钙含量、骨密度和骨强度,显著降低血清ALP含量,而且效果显著优于无机钙。

4 结论

本文通过缺钙大鼠模型动物实验证明EPP-Ca能显著促进大鼠增重、显著增加大鼠钙吸收率、血清钙水平、股骨重量、骨密度、骨钙含量和生物力学指标、显著降低血清碱性磷酸酶含量,而且补钙效果优于无机钙,与CPP-Ca效果相当。EPP-Ca有望成为新型的补钙制剂。

[1]Jung WK,Park PJ,Byun HG,etal. Preparation of hoki(Johnius belengerii)bone oligophosphopeptide with a high affinity to calcium by carnivorous intestine crude proteinase[J]. Food Chem,2005,91:333-340.

[2]Kim SK,Byun HG,Lee EH. Optimum extraction conditions of gelatin from fish skins and its physical properties[J]. J Korean Indus Eng Chem,1994,5:547-559.

[3]Jeon YJ,Kim SK. Continuous production of chitooligosaccharides using a dual reactor system[J]. Process Biochem,2000,35:623-632.

[4]Falch E,Rustadb T,Jonsdottir R. Geographical and seasonal differences in lipid composition and relative weight of by-products from gadiform species[J]. J Food Compos Anal,2006,19:727-736.

[5]Tsuchita H,Goto T,Shimizu T,etal. Dietary casein phosphopeptides prevent bone loss in aged ovariectomized rats[J].J Nutr,1996,126:86-93.

[6]Jung WK,Lee BJ,Kim SK. Fish-bone peptide increases calcium solubility and bioavailability in ovariectomised rats[J]. British Journal of Nurtrition,2006,95:124-128.

[7]Choi I,Jung C,Choi H. Effectiveness of phosvitin peptides on enhancing bioavailabilityof calcium and its accumulation in bones[J]. Food Chemsitry,2005,93:577-583.

[8]韩樱,何慧,赵宁宁,等. 蛋清肽-钙配合物体内促钙吸收作用研究[J]. 食品科学,2012,33(11):262-265.

[9]陈瑞仪,谭剑斌,周轶琳,等. 氨基酸螯合钙增加骨密度作用的实验研究[J]. 氨基酸和生物资源,2011,33(1):60-62.

[10]Li YH,Huang H. Enzymatic preparation of carp roes’ hydrolysate with Ca-binding capacity[J]. Advanced Materials Research,2012,554-556:1309-1317.

[11]何丽,薛安娜,付萍. 多种钙剂不同钙含量对大鼠钙吸收及骨密度的影响[J]. 卫生研究,2002,31(4):258-260.

[12]吕莹. 大豆肽结合钙的机制及其促进机体钙吸收和增强骨质量的生物学效应[D].北京:中国农业大学,2010.

[13]Nordin BEC. Calcium and osteoporosis[J]. Nutrition,1997,13:664-686.

[14]Kerstetter JE,Brien KOO,Insogna KL. Dietary protein affects intestinal calcium adsorption[J]. Am J Clin Nutr,1998,68:859-865.

[15]Straub DA,Ranch C. Calcium supplement in clinical practice:A review of forms,doses,and indications[J]. Nutr Clin Practice,2007,22:286-296.

[16]Perez AV,Picotto G,Carpentieri AR. Minireview on regulation of intestinal calcium absorption[J]. Digestion,2008,77:22-34.

[17]Bronner F. Recent developments in intestinal calcium absorption[J]. Nutrition Reviews,2008,67(2):109-113.

[18]Hoenderop JGJ,Nilius B,Bindels RJM. Calcium absorption across epithelia[J]. Physiol Rev,2005,85:373-422.

[19]Sato R,Noguchi T,Naito H. Casein phosphopeptide(CPP)enhances calcium absorption from the ligated segment of rat small intestine[J]. Journal of Nutritional Science and Vitaminology,1986,32:67-76.

[20]Mykkanen HM,Wasserman RH. Enhanced absorption of calcium by casein phosphopeptides in rachitic and normal chicks[J]. Journal of Nutrition,1980,10:2141-2148.