L-异亮氨酸高产菌种的选育研究

谢飞，崔国英，王翀，江兵，沈联兵，虞龙

（1.宜昌三峡制药有限公司，湖北宜昌443000；2.南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京211186）

L-异亮氨酸高产菌种的选育研究

谢飞1，崔国英1，王翀1，江兵1，沈联兵1，虞龙2

（1.宜昌三峡制药有限公司，湖北宜昌443000；2.南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京211186）

以谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）为出发菌株，利用低能氮离子束注入对其进行多次诱变，结合异亮氨酸氧肟酸盐（IleHx）等氨基酸结构类似物定向筛选，得到一株稳定的高产L-异亮氨酸菌株：摇瓶培养72 h，产酸可达21～22 g/L，在50 L发酵罐上发酵51 h，产酸可达32 g/L。

L-异亮氨酸；离子束注入；诱变

L-异亮氨酸（L-isoleucine，L-Ile）是人体8种必需氨基酸之一，也是3种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位[1]。食品方面主要用于食品强化，提高食品的营养价值。医药方面，3种支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）组成的复合氨基酸输液，对治疗脑昏迷、肝昏迷、肾病等具有显著疗效，并可取代糖代谢提供能量[2-3]。

目前，国内从事L-异亮氨酸生产的企业不少，如河南味之素氨基酸公司、无锡晶海氨基酸公司、南宁赢创美诗药业有限公司、山东鲁洲氨基酸有限公司、湖北八峰药化有限公司、山东阜丰发酵有限公司、宜昌三峡制药有限公司等，其中味之素公司的发酵水平领先，为35 g/L左右。而L-异亮氨酸高产菌株的选育是提高发酵生产能力的关键。

作为一种遗传改良新方法，离子束诱变育种具有能量沉积、动量传递、粒子注入和电荷交换等4个原初反应过程，其作用机制相当复杂[4-5]。离子束诱变的起因不仅是由于能量沉积引起的DNA单双链断裂，并且还通过离子注入过程中质、能、电多因子作用使遗传物质分子原子发生移位和重组，且其突变性状具有多发性和重复性的特点[6-7]。

本研究利用低能氮离子（N+）注入改良发酵生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌，筛选出1株高产菌株，使发酵水平有了一定程度的提高。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum），宜昌三峡制药有限公司保藏菌种。

筛选斜面培养基：葡萄糖5 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，异亮氨酸氧肟酸盐40g/L，琼脂20g/L。

种子培养基：葡萄糖25～35 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，玉米浆20～30 g/L，碳酸钙10 g/L。

发酵培养基：葡萄糖120～150 g/L，硫酸铵25～40 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，玉米浆20～30 g/L，碳酸钙25～30 g/L。

1.2 仪器与设备

LZD900多功能离子注入机：核工业西南物理研究院研制；721G分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；pHS-25型精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；SBA-40系列生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所；Ultimate3000液相色谱仪：美国戴安公司；ZHY-2112B双层特大容量全温度恒温摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司；FUS-50L（A）发酵罐：上海国强生化工程装备有限公司。

1.3 低能离子注入工艺与样品处理

用5 mL无菌水洗脱新鲜斜面（培养24 h），振荡，制成一定浓度的菌悬液。取0.1 mL菌悬液均匀涂布于无菌空培养皿上，用无菌风吹干后进行N＋注入。离子注入机为LZD900多功能离子注入机，使用以20keVN＋、不同剂量进行注入，靶室真空度为10-3Pa。N＋注入后取出平皿，以1 mL无菌水洗脱，涂筛选平板培养基，于30℃培养2～3 d用于单菌落的挑选。

1.4 筛选方法

将平板筛选获得的变异株接1环于装有12.5 mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃振荡培养72 h，用纸层析法分离，比色法测定发酵液中的L-异亮氨酸。根据单位体积发酵液中异亮氨酸的产量确定高产菌株。

1.5 分析方法

发酵液中残糖：采用SBA-40系列生物传感分析仪测定。

OD值：稀释25～50倍后，在波长562 nm处用分光光度计测定。

L-异亮氨酸含量：初步测定采用纸层析——分光光度计定量法测定[8]；准确测定采用液相色谱测定[9]。

2 结果与分析

2.1 存活率曲线

N+注入谷氨酸棒状杆菌的存活率曲线见图1。从图1可知，谷氨酸棒状杆菌的存活率符合“马鞍型”剂量—效应曲线[10]，即存活率先减少再增加，然后减少。

图1 N+注入谷氨酸棒状杆菌的存活率Fig.1 Survival rate ofCorynebacterium glutamicumimplanted by N+

由于诱变机理复杂，出现这种现象的原因可能是：低剂量时离子只对细胞表面进行损伤，因而存活率较高；随着注入剂量的增加，细胞表面刻蚀严重，离子进入细胞内部并产生大量自由基和软射线等，使存活率急剧下降，但下降到一定值时，细胞某种修复机制被激活，使得存活率有所回升；当剂量增加到一定时，细胞损伤已无法修复，存活率再次下降[11]。

2.2 菌种筛选

从平板筛选出来的菌株，经种子瓶转接至发酵培养基中逐个发酵，测定L-异亮氨酸含量。同时与出发菌株对照计算突变率，挑取高产菌株进一步发酵验证。得到的高产菌株，经遗传稳定验证后，进行下一步诱变筛选。采用能量20 keV的N+，以30×1013～210×1013N+/cm2为处理剂量对菌株进行诱变筛选，结果见图2。

图2 N+注入谷氨酸棒状杆菌的突变率Fig.2 Mutation rate ofCorynebacterium glutamicumimplanted by N+

由图2可知，以150×1013N+/cm2为最佳处理剂量，该处总突变率较高，且正突变率高于负突变率，表明以该剂量进行离子注入可获得较多的正突变菌株，有助于筛选工作的进行。经过多轮筛选，获得1株高产突变菌株，将菌株实际发酵水平提高到22 g/L。为验证高产突变菌株的遗传稳定性，对这些菌株进行了连续5代的传代试验和发酵能力的考察，结果见表1。

表1 高产突变株遗传稳定性试验Table 1 Genetic stability of high-yield mutant strain

表1结果表明，所得到的这些高产菌株在5代仍保持较高的发酵能力，具有良好的遗传稳定性。

2.3 发酵罐小试验证

虽然摇瓶筛选中温度和转速的控制比较准确，但发酵过程的pH控制比较粗放，且溶氧、残糖水平也难以保证菌种处于最佳水平。为了验证菌种在发酵罐上的生产水平，利用50L自动控制发酵罐进行试验，可克服摇瓶的不足，检验菌种在实际应用中的生产能力。

50 L罐分批发酵过程中残糖、产酸和OD562nm监测结果见图3。

图3 50L罐分批发酵过程趋势曲线-1(残糖、产酸和OD562nm的变化)Fig.3 Batch fermentation curve-1 in 50-liters fermentor(change of residual sugar,acid production,OD562nm)

由图3可知，发酵前期，菌体以生长为主，葡萄糖消耗的速度比较快，此期间菌体生长代谢中产生的L-异亮氨酸主要用于自身合成；进入发酵中期，通过控制残糖浓度在一定水平，促使菌体代谢由生长向产物合成迁移，发酵液中L-异亮氨酸的含量逐步提高；到了发酵后期，菌体活力降低，OD562nm维持在一定水平。由于在菌种诱变时采用异亮氨酸氧肟酸盐进行定向筛选，减少了产物的反馈抑制，因此发酵液中L-异亮氨酸的含量继续增加，直至发酵结束[12-13]。该菌株产L-异亮氨酸水平为3.2%，即32g/L。

图4 50L罐分批发酵过程趋势曲线-2(耗氧速率、二氧化碳释放率、溶氧、尾气的变化)Fig.4 Batch fermentation curve-2 in 50-liters fermentor(change of OUR,CER,DO,tail gas)

分析图4可知，发酵前期，菌体快速生长，耗氧速率（oxygen uptake rate，OUR）、二氧化碳释放率（carbon dioxide evolution rate，CER）迅速上升，溶氧（dissolved oxygen，DO）下降明显，因此尾气中氧含量下降比较快；进入发酵中期，OUR、CER继续升高，但CER上升速度更快，两者呈“分叉”趋势，表明菌体进入了碳源限制状态[14]，开始利用培养基中的氨基酸作为碳源，微生物转入初级代谢，此时DO需维持在一定范围内，促进并维持代谢流的这种变化。由于产物的合成产生CO2，尾气中CO2值快速提升，并高于氧气值，表明代谢强度逐渐升高；进入发酵后期，由于残糖浓度降低，加之菌体活力下降，OUR、CER同步下降，同时尾气中氧含量逐渐升高，表明代谢趋于结束[15-16]。

3 结论

通过运用离子注入技术诱变选育生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌，建立N+注入诱变该菌的方法并总结了N+注入后生物学效应规律。经过多轮筛选得到1株高产突变株：与出发菌株相比，发酵产L-异亮氨酸的能力提高约10%左右，L-异亮氨酸的水平达到22 g/L左右，说明N+注入诱变技术对提高L-异亮氨酸发酵水平具有比较好的效果。通过在50 L发酵罐上进行小试，菌种产酸可达32 g/L。

本研究通过对原有L-异亮氨酸生产菌种进行诱变选育，提高了其发酵水平，同时也为该菌种日后的诱变提高奠定了基础。

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Breeding of high L-isoleucine producing strains

XIE Fei1,CUI Guoying1,WANG Chong1,JIANG Bing1,SHEN Lianbing1,YU Long2
(1.Yichang Sanxia Pharmaceutical Co.,Ltd.,Yichang 443000,China;2.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology,Nanjing 211186,China)

UsingCorynebacterium glutamicumas original strain,through low energy N+implanting intoC.glutamicum,combining with isoleucine hydroxamic(IleHx)and other amino acid structure analogues to conduct directed screening,one high L-isoleucine yield mutant strain was obtained. After 72 h fermentation in shaking flask,the concentration of L-Ile was 21-22 g/L,and after 51 h fermentation in 50-liters fermentor,the concentration of L-Ile was 32 g/L.

L-Isoleucine;ion implantation;mutation

TQ922

A

0254-5071（2014）11-0098-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.022

2014-08-19

江苏省高校自然科学研究计划（03KJB180038）

谢飞（1982-），男，工程师，硕士，研究方向为工业微生物菌种诱变选育及小试研究。