添加S酵母对牛肉酱基质的影响

许静，王锦辉，周锡龙，侯丽华，王春玲

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

添加S酵母对牛肉酱基质的影响

许静，王锦辉，周锡龙，侯丽华，王春玲

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

研究了S酵母的添加对牛肉酱基质发酵过程中理化指标以及对成品酱有机酸含量和挥发性风味物质的影响，结果表明，S酵母的添加在理化指标方面使得成品牛肉酱的还原糖含量由3.05 g/100 mL降低到了1.05 g/100 mL，同时乙醇含量由0.29 g/100 mL上升至0.54 g/100 mL。有机酸方面，S酵母的添加使酱基质中多检测出了琥珀酸和酒石酸，并大幅度提高了乳酸、乙酸、柠檬酸和富马酸的含量。挥发性风味物质的检测结果表明，S酵母的加入使得风味物质重点增加了醇类的数目及种类，并影响了酯类的组成。

S酵母；牛肉酱；有机酸；风味物质

牛肉酱在调味品行业中十分常见，不仅有突出牛肉味的传统牛肉酱[1]，也有许多复合调味酱[2]如胡萝卜香辣牛肉酱等[3]。尽管有关牛肉酱的工艺很多，但多为调配酱、复合调味酱或者传统纯肉酱，关于酱香型牛肉酱方面，还鲜有文献记载。本研究中牛肉酱的制作是以低盐固态酱油的酿造工艺[4-6]为基础，利用米曲霉沪酿3.042发酵而成的一种酱香醇厚型牛肉酱。

在酱制品的发酵过程中，食盐的含量很高，由于水分蒸发等因素使得酱醪的含盐量可能＞18%，严重抑制了酵母菌生长活力。所以，向酱醪中添加耐盐产香酵母已成为目前人们提高酱油风味的主要手段[7]。鲁氏酵母（S酵母）是传统发酵制品中经常用到的一种耐盐酵母。它与醇类、酸类及酯类等物质的产生有着紧密的关系，对酱油风味的形成起着至关重要的作用[8]。侯丽华等[9]通过调控甘油含量调节了S3-2酵母的耐盐性，为S酵母的高盐环境下的生长提供了理论依据。李琴等[10]在低盐固态发酵工艺生产的二油、三油中添加了S酵母AS 2.180和球拟酵母AS 2.202进行再发酵，结果采用新工艺生产的酱油无论在感官指标还是理化指标都比国内天然酱油要好。尽管S酵母在酱油相关研究中较为深入，但其在牛肉酱方面的应用还并未有相关文献记载。因此，本实验在牛肉酱基质发酵过程中添加S酵母，目的在于改善此种发酵型牛肉酱的风味，得到一种酱香、肉香和谐美味的新型牛肉酱。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛肉、豆粕、炒小麦、面粉、香菇粉、食盐：市售。

2）基于PLC的给排水控制系统可通过考虑水位及压力控制原则，使水泵运行中的自动转换操作得以实现，从而延长给排水控制中水泵的使用寿命；

米曲霉（Aspergillus oryzae）沪酿3.042、鲁氏酵母（Saccharomyces rouxii）：由天津科技大学菌种保藏中心提供。

磷酸、蛋白胨、酵母粉、亚铁氰化钾：天津市英博生化试剂有限公司；H2SO4、HCl、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铜均为分析纯：天津市化学试剂厂；乙酸、乳酸、丙酸、柠檬酸、富马酸、甲酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸均为色谱纯：天津市科密欧化学试剂开发中心。

1.2 仪器与设备

KG22N冰箱：西门子有限公司；DHG-9203B干燥箱：上海市实验仪器厂；RH2104电磁炉：天津实验仪器厂；95-1磁力搅拌器：上海司乐仪器厂；LRH-250-A生化培养箱：广东省医疗器械厂；PHSJ-4A型PH计：美国奥立龙公司；Agilent 1100高效液相色谱分析仪、GC-2000气相色谱分析仪：日本岛津公司；RE5003旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器；LGR16-W冷冻离心机：德国Heraeus公司；SKD-100凯氏自动定氮仪（上海新嘉电子有限公司）；HZF-A100分析天平：上海天平仪器厂。

彩色多普勒超声检查费用较低，可以实现检查的重复性，具备的敏感性和简单化更高，适合血管血流各个阻力指标的分析。子宫螺旋动脉为其中的主要血管，胎儿生长发育期间需要的营养物质和氧气都通过胎盘得到。子宫螺旋动脉为妊娠血流供应的主要因素，当前，还无法给予血流量、血流速度等指标的检测，所以，引进彩色多普勒超声检查，能对高危妊娠子宫螺旋动脉血流动态全面监测，避免给胎儿带来不良反应[5]。

1.3 方法

稀浆混合料加入纤维后，多向随机、纵横分布的纤维分布，形成了复杂的空间网络结构，使得混合料中结构沥青的比例大幅度提升，沥青胶浆的黏滞性得到提升，提高了高温稳定性，使微表处的使用寿命得到提升。

那么到底是什么样的时代催生了这样一个现当代有深远影响的大艺术家，又是谁在何种情境下置其于绝境？看完展览人们不能不发问，但也只能得出语焉不详的结论。

1.3.1 牛肉酱加工工艺流程

1.3.2 S酵母的活化

《星星》是毛泽东以给林彪回信为由、以党内通信形式印发给红四军干部纠正党内悲观思想的一封信。 当时，中央革命根据地曾以《时局的估量与红军行动问题》为题印发过油印的单行本，发至党内领导干部传阅。 该信的公开发表是在延安整风期间。 1941年12月，毛泽东亲自主持编印了党内秘密文件《六大以来》，将此文作为整风运动文献编入其中，题名为《毛泽东同志给林彪同志的信》(以下简称“1941年版”)，此后，该文经历了中华人民共和国成立前和成立后两个历史阶段的变化历程。

液相色谱条件：色谱柱（HydrospHere C18，250 mm× 4.6 mm）；流动相0.03 mol/L KH2PO4（磷酸调pH值为2.8）；检测波长215 nm；流速0.5 mL/min；进样量20 μL。

S酵母的培养：从S酵母斜面培养基上各挑取一环菌，接入5 mL三角瓶装YPD液体培养基中，于30℃、150 r/min条件下过夜活化培养，24 h后取1%接种至新的培养基，重复两次。

1.3.3 种曲的制备

将麸皮与110%的水混合灭菌，晾凉至约30℃时接入米曲霉，30℃恒温培养约72 h后，当种曲整体全部呈现墨绿色，说明种曲成熟，测定其孢子数和水分，自然风干即为种曲。

1.3.4 大曲的制备

将原料按豆粕/麸皮/炒小麦/香菇粉/水=3∶1∶1∶1∶6混合均匀，灭菌后接入3‰的种曲，于30℃恒温培养约40 h，待曲料呈黄绿色，说明大曲成熟。

1.3.5 制醪发酵

（1）样品A的制备（工艺A）：白术、豆蔻、大黄、炙甘草、1/3山药粉碎成细粉，黄芪等其余味药材煎煮2次，每次加10倍量水，煎煮2 h，滤过，滤液减压浓缩成稠膏，与上述药材细粉混匀，真空干燥，粉碎制成1 g细粉相当于1.41 g生药。

由图6可知，10种有机酸得到了良好分离，出峰时间分别为：1甲酸5.341 min、2乙酸5.654 min、3乳酸6.150 min、4丙酸6.621 min、5柠檬酸7.309 min、5酒石酸8.837 min、7草酸8.837 min、8苹果酸9.635 min、9琥珀酸10.742 min、10富马酸14.247 min。

1.3.6 理化指标的测定方法

郑成川伸手拦住一位准备上前的黑旗会灰衣杀手迎向武成龙，话也不说双手就指天画地，紧接着右手掌向前一翻，因为他成名至今还没有人敢公然在他面前蔑视地勾动食指。一股旋转的劲气向武成龙冲击的同时郑成川左手幻动，五缕指风在啸声中劲射。人随掌进，一击必杀！

总酸测定、pH测定、氨基酸态氮测定按照GB/T5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》中的方法进行；还原糖含量测定按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法进行；乙醇含量测定按照吸光光度法；全氮测定按照凯氏定氮法。

1.3.7 有机酸的测定方法

流动相的配制：准确称取4.082 7 g KH2PO4，用三蒸水溶解，并定容至1 000 mL容量瓶中，随后用磷酸调节pH至2.8，再经0.45 μm微孔纤维素滤膜抽真空过滤，脱气30 min后备用。

样品预处理：称取10 g样品用三蒸水定容100 mL容量瓶中。取一定量的稀释液（6 000 r/min，10 min）离心，取上清液用三蒸水稀释10倍后经0.22 μm微孔纤维素滤膜过滤后直接进样。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基[11]：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，121℃灭菌15 min。

有机酸的定性定量方法：以样品的出峰时间和有机酸混合标准品溶液的出峰时间比较来进行定性。以峰面积的外标法定量，峰面积和进样量作十种有机酸的标准曲线。

1.3.8 挥发性风味物质的测定方法

成品酱中风味物质的测定采用固相微萃取-气质联用（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spec trometry，SPME-GC-MS）的方法进行。该方法是在GAOXL等[12]的研究基础上稍作修改得到的。

课后拓展实验材料用具：大水槽2个，漓江中的水草、螺蛳、鳅鱼等生物适量，pH为4.4的溶液和pH为5.0的溶液模拟酸雨，塑料桶一个，量筒2个，加压喷壶2个，大玻璃板一块，鼠妇20只，蚯蚓9条，解剖盘4个。

（1）样品处理

称取酱油5g于干净的顶空瓶中，45℃水浴平衡30min，萃取头吸附30 min。

（2）分析条件

由图3可以看出，106CFU/mL S酵母的引入对牛肉酱基质总氮含量的影响并不大，较空白组来讲，只有略微的增加，造成该现象的原因可能是菌体自身蛋白物质的引入。

质谱条件：接口温度为280℃，离子源温度为220℃，溶剂延迟时间为1.5 min，电子能量为70 eV，扫描质量范围为43～500 u。

运用公式计算各朝代(或时代)或各市州的文物分布综合指数[25-26]，式中Kj为权重系数.不同类型的文物在价值上有所不同，年代越远，历史价值越高，故本研究利用Delphi(特尔菲)法确定各类型文物的权重系数取值.其中，古建筑及历史纪念建筑物、古墓葬、古遗址、石窟寺及石刻为0.2，近现代重要史迹及代表性建筑为0.12，革命遗址及革命纪念建筑物为0.08.

HP化学工作站软件对照NIST 05库进行数据收集，谱库初步鉴定物质成分，结合保留时间、质谱、试剂成分和保留指数定性。面积归一化法相对定量。

酱制品中的蛋白质在蛋白酶和肽酶等的作用下逐步分解为胨、肽及氨基酸，氨基酸态氮就是一类以氨基酸形式存在的含氮化合物。酵母的添加对牛肉酱基质氨基酸态氮的影响结果见图2。

发酵成熟的牛肉酱基质，采用九分嗜好评分法[13]分别对不同原料配比的牛肉酱基质进行风味强度、酱香味、醇厚感、和谐型、留香以及回甜的可接受度进行喜好评分，1到9分别代表极度不喜欢、非常不喜欢、适度不喜欢、轻微不喜欢、既不喜欢也不讨厌、轻微喜欢、适度喜欢、非常喜欢、极度喜欢。整个评定过程由专业的感官评价人员进行，整个评定过程采用10人制，将所得结果去掉最大值和最小值后取平均值。

2 结果与分析

2.1 S酵母的添加对牛肉酱基质酸度的影响

克里斯蒂娜皱了皱鼻子，继续兴致勃勃地说：“德鲁就是皮特的走狗，我怀疑他脑子里没有自己的想法。至于莫莉……她这人很变态，她是那种为了看蚂蚁来回扭动，就拿放大镜烧死蚂蚁的人。”

酱制品的酸味一部分来源于制曲和发酵过程中的一些产酸菌（如乳酸菌、酱油片球菌等）的繁殖，产酸菌分解利用碳水化合物产生酸类（主要为乳酸）；一部分来源于各种氨基酸的溶出和合成以及含羧基端的多肽类物质，适量酸味可以中和酱中的咸味，使酱的滋味变得柔和，但是总酸含量＞3%时便会使酱的滋味变差。S酵母的添加对牛肉酱基质酸度的影响结果见图1。

图1 添加S酵母的牛肉酱基质与空白组pH(A)及总酸(B)的动态变化Fig.1 Dynamic change of pH(A)and total acid(B)of beef paste with S yeast and without S yeast

由图1可以看出，106CFU/mL的S酵母的添加对牛肉酱基质酸度的影响并不大。只是在发酵期间使得酸度略高于空白组，但最终也与空白组相差不大，都保持在1.5 g/100 g左右的正常值。

2.2 S酵母的添加对牛肉酱基质氨基酸态氮的影响

1.3.9 感官评价的方法

由图2可以看出，按照106CFU/mL酱醪添加了S酵母之后，从第6天开始，酱醪中氨基酸态氮含量较空白组开始明显增高，发酵结束时，空白组的氨基酸态氮处于约0.9 g/100 g，而添加S酵母的牛肉酱基质最终氨基酸态氮含量处于约1.05 g/100 g。造成此结果的主要原因是酱醪中剩余的蛋白酶系继续分解利用蛋白质生成氨基酸以及酵母菌菌体自身蛋白的带入。

图2 添加S酵母的牛肉酱基质与空白组氨基酸态氮的动态变化Fig.2 Dynamic changes of amino acid nitrogen of beef paste with S yeast and without S yeast

2.3 S酵母的添加对牛肉酱基质总氮含量的影响

（3）风味物质定性定量分析

全氮是酱醪中含氮化合物的总称，包括可溶性的蛋白质和胨类、肽类和氨基酸。S酵母的添加对牛肉酱基质总氮含量的影响结果见图3。

图3 添加S酵母的牛肉酱基质与空白组总氮的动态变化Fig.3 Dynamic changes of total nitrogen of beef paste with S yeast and without S yeast

色谱条件：VF-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；载气：纯度为99.999%的氦气，流量1 mL/min，分流比5∶1；升温程序：起始温度40℃，30 min，然后4℃/min的速度上升至150℃，1min后，8℃/min的速度上升至250℃，保持6 min。

2.4 S酵母的添加对牛肉酱基质还原糖含量的影响

在发酵过程中，碳水化合物在淀粉酶和糖化酶的作用下逐步分解为还原糖，还原糖一部分被微生物利用，生成醇类、酸类，另一部分与氨基酸发生美拉德反应用于酱的着色，所以还原糖含量的高低直接影响到酱的色香味。还原糖是指所有能还原斐林试剂的糖，包括全部的单糖以及大部分的二糖。S酵母的添加对牛肉酱基质还原糖含量的影响结果见图4。

图4 添加S酵母的牛肉酱基质与空白组还原糖的动态变化Fig.4 Dynamic changes of reducing sugar of beef paste with S yeast and without S yeast

由图4可以看出，106CFU/mL S酵母加入酱醪之后，短暂的调整之后便开始进行发酵。由于酵母菌的新陈代谢，酱醪中的还原糖含量急剧降低。

2.5 S酵母的添加对牛肉酱基质乙醇含量的影响

乙醇本身是一种香气物质，也是合成乙酯类的前体物质。S酵母的添加对牛肉酱基质乙醇含量的影响结果见图5。

图5 添加S酵母的牛肉酱基质与空白组乙醇的动态变化Fig.5 Dynamic changes of ethanol content of beef paste with S yeast and without S yeast

由图5可以看出，106CFU/mL添加S酵母之后的牛肉酱基质乙醇含量急剧上升，发酵结束时，添加S酵母的牛肉酱基质乙醇含量约为0.54 g/100 mL，而空白组的乙醇含量约为0.28 g/100 mL。由此可以看出，S酵母的添加促进的牛肉酱基质中乙醇的产生。

2.6 添加S酵母对牛肉酱基质中有机酸的影响

2.6.1 有机酸混合标准溶液的液相图谱

草酸、酒石酸、柠檬酸等10种有机酸的混合标准溶液进样20 μL，得到10种有机酸混合标准溶液的液相图谱，结果见图6。

大曲成熟后，将处理好的牛肉/曲料按照9∶12（制曲前曲料及生肉计）混合均匀，将整体按加水量/原料质量比为1∶1，拌以14°Bx的盐水（40℃）装入发酵罐，保存于42℃的保温箱中进行前期发酵。10 d以后，调整温度至30℃，按106CFU/mL接入S酵母，培养20 d即可。

在与他人沟通的角色上，69.60%的大学生持有积极情感，以强调人际交往中的主动性、指引他人为价值取向；30.40%的大学生持消极情感，以强调人际交往中的被动性为价值取向。

图6 10种有机酸的混合标准溶液液相图谱Fig.6 Chromatogram of mixed standard solution of ten organic acids

2.6.2 牛肉酱汁中有机酸的液相色谱分析结果

添加106CFU/mL的S酵母与空白组中牛肉酱基质有机酸含量检测的高效液相色谱图见图7，有机酸含量结果见表1。

图7 添加S酵母(A)及空白组(B)牛肉酱基质有机酸液相色谱图Fig.7 Chromatogram of organic acid in beef paste with S yeast(A) and without S yeast(B)

酱制品中含有多种有利于身体健康的有机酸。有机酸在酱油中能够使酱油的盐味变得柔和，同时还是生成酯类物质的原料。这些有机酸是发酵过程中酱醪中的微生物产生的。

由表1可以看出，空白组共检测出有机酸7种，而添加了S酵母的牛肉酱基质中共检出有机酸9种，多检出了酒石酸和琥珀酸，并且乳酸、乙酸、柠檬酸及富马酸含量明显增加。由此可见，S酵母的添加能够明显增加牛肉酱基质的有机酸种类及含量。

表1 S酵母添加与空白组酱汁中有机酸含量的对比Table 1 Comparison of organic acids between beef paste with S yeast and without S yeastg/L

2.7 添加S酵母对牛肉酱基质挥发性风味物质的影响

借助课外实践探究活动，让学生将学习到的数学知识应用到实际的问题当中，学生在解决问题的过程中，即可以体验到成就感，同时可以提高综合应用能力.

酱制品中的风味物质分为以下几大类：醇类、酯类、吡嗪类、酚类、醛类、酸类、酮类以及呋喃类[14]。风味物质一方面来源于原料本身的风味成分，另一方面来源于原料中的蛋白质、淀粉等大分子物质在发酵过程中逐步分解的各种小分子物质，以及酱醪中微生物产生的代谢产物，这些物质再发生一系列复杂的生物化学反应生成各种新物质，并可作为风味物质的前体[15-19]。按106CFU/mL添加S酵母的牛肉酱基质与空白组牛肉酱基质中风味物质检测的总离子流色谱图见图8，风味物质含量结果见表2，风味物质种类对比见表3。

图8 添加S酵母(A)及空白组(B)牛肉酱基质中挥发性风味物质的总离子流色谱图Fig.8 T