毛木耳优良杂交菌株的选育*

姚方杰，孙文娟，鲁丽鑫，王 鹏，陆 甲，张友民**

（1.吉林农业大学园艺学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学食用菌新种质资源创制国际联合研究中心，吉林 长春 130118；3.吉林省农业科学院经济植物研究所，吉林 公主岭 136105）

毛木耳（Auricularia cornea Ehrenb.），是担子菌门 （Basidiomycota） 蘑菇纲 （Agaricomycetes） 木耳目 （Auriculariales） 木耳科 （Auriculariaceae） 木耳属（Auricularia） 的一种胶质真菌[1]。毛木耳在我国17个省市（直辖市、自治区）均有栽培，其口感脆滑，素有“树上海蜇皮”之美称，是一种营养丰富，保健功能强大的天然食（药） 用菌[2-3]。

根据中国食用菌协会统计，2017年我国毛木耳总产量约为168.64万吨，为我国第六大食用菌[4]。毛木耳生产周期较短，生物学效率高，栽培技术简单且生产经济效益高，因此已经成为很多贫困地区脱贫致富的首要选择项目之一[5]。伴随着产业规模逐步的加大，市场上出现随便引种、品种退化、产量降低等诸多问题[6]，同时市场呈现多元化，消费者对于毛木耳的需求逐年增加，对毛木耳的口感、色泽、品质等要求趋于多样。目前市场上毛木耳优良品种匮乏，极大地阻碍了毛木耳产业的发展，因此加强优良品种选育是毛木耳产业健康发展的重要内容[4]。为此开展毛木耳颜色与商品性状的遗传研究和优良杂交品种选育，为进一步的遗传育种提供科学依据，为生产提供优良品种。

1 材料与方法

1.1 亲本菌株

亲本一为栽培毛木耳菌株ZP，浅褐色，耳片大，扁圆形；亲本二为野生毛木耳菌株YZ，白褐色，耳片小，近圆形。菌种均保存于吉林农业大学园艺学院。对照品种（CK） 为海南省当地栽培品种，与栽培菌株ZP相比，子实体较小，颜色较深。

1.2 杂交菌株制备

2个亲本菌株的成熟耳片制备孢子印→单孢分离→单核菌株→单单杂交→杂交菌株，具体方法参照参考文献[7]。

1.2.1 孢子的收集与分离

选择毛木耳成熟的耳片，用75%的酒精擦拭子实体表面，再用无菌水冲净，后用无菌滤纸吸取多余水分，将其腹面朝下置于无菌的培养皿中，12 h后培养皿底部可见1层白色的孢子印，取出子实体，封口培养皿待用[8]。

在超净工作台中，加入无菌水200 μL至收集到的含有孢子印的培养皿中，制成孢子悬浊液，用血球计数板计数后用无菌水稀释至浓度为100个/mL，用移液枪吸取200 μL的孢子悬浊液至平板培养基并用无菌的涂布器涂抹均匀，封口后置于25℃培养箱中培养。每天观察孢子的萌发情况，当培养基上出现星芒状小菌落时，及时分离小菌落并挑取转接至斜面培养基中，进行编号命名后置于25℃培养箱中培养。

1.2.2 单核菌丝的鉴定

分别配置质量分数为10%的KOH溶液和1%刚果红溶液，并各加入1滴在载玻片上，挑取培养后的单菌落置于溶液中并盖上盖玻片。将制好的玻片置于光学显微镜（物镜40倍，目镜10倍）中观察菌丝有无锁状联合，无锁状联合的菌株为单核菌株[8]。

1.2.3 杂交组合的制备

分别将两亲本菌株的单核菌丝接入到同一平板培养基中，菌块相距约1 cm，25℃进行培养。待2个菌株的菌丝充分接触后，挑取中间部位至斜面培养基中，并编号命名，置于25℃培养箱中培养。

1.2.4 杂交菌株的鉴定

双核菌株的鉴定参考1.2.2，从有锁状联合的菌株中选择菌株ZP的1个单核菌株与菌株YS的3个单核菌株分别杂交，菌株ZP的3个单核菌株与菌株YS的1个单核菌株分别杂交，共形成5个杂交菌株（ZP-1×YS-1，ZP-1×YS-8，ZP-1×YS-17，ZP-2×YS-17，ZP-6×YS-17）。将杂交菌株与两亲本接入到同一平板培养基中，两两菌块相距约2 cm，呈品字排列，25℃培养箱中培养。观察杂交菌株与亲本是有无明显的拮抗线，淘汰与亲本没有拮抗线的菌株。再将杂交菌株之间对峙培养，观察杂交菌株之间有无明显的拮抗线，若无拮抗线，将其中生长势较弱的菌株淘汰[9]。

1.3 商品性状遗传分析

从杂交菌株中选出5个杂交菌株（ZP的1个单核菌株与菌株YS的3个单核菌株分别杂交，菌株ZP的3个单核菌株与菌株YS的1个单核菌株分别杂交），将其与两亲本同时开展进行出耳试验，调查商品性状（颜色、耳片形状、大小），用于遗传分析。

1.4 生产试验

将5个杂交菌株和对照品种同时在海南进行生产试验，常规管理。培养料配方为菌草15.0%、木屑 62.0%、麦麸 20.0%、石灰 1.5%、石膏 1.5%，含水量58%～60%。调查生育期、产量具体方法按参照参考文献[10]。

2 结果与分析

2.1 杂交组合的制备与真实性鉴定

将收集的亲本菌株ZP和亲本菌株YS的孢子印分离并培养，菌株经过镜检获得单核菌株。选择长势较好的单核菌株进行单单杂交，共制备了100个杂交子。通过镜检确定这些杂交组合均具有锁状联合，为真实杂交菌株。5个杂交菌株与两亲本进行两两拮抗试验，结果如表1所示。

表1 杂交菌株的拮抗反应Tab.1 The antagonistic reaction among Auricularia cornea hybrids

从表1可以看出，杂交菌株与亲本之间均产生拮抗，各杂交菌株之间均产生拮抗现象，说明杂交菌株与两亲本以及杂交群体之间均为生理特性不同菌株。

表2 杂交菌株与亲本的商品性状Tab.2 Commercial character of Auricularia cornea hybrids

2.2 商品性状遗传

杂交菌株与亲本的商品性状统计见表2。

如表2所示，亲本菌株ZP的1个单核菌株与另一亲本菌株YS的不同单核菌株进行杂交，亲本菌株ZP的3个单核菌株与另一亲本菌株YS的1个单核菌株进行杂交，杂交菌株商品性状差异明显。两亲本杂交出来的F1菌株颜色均比亲本颜色深，表现为超亲遗传，其中菌株ZY1、ZY3、ZY4为深褐色，菌株ZY2、ZY5为褐色。耳片厚度表现为超亲遗传，由大到小依次为ZY5>ZY4>CK>ZY1>ZY2>ZY3=ZP>YS。耳片长宽比更小，呈扁宽圆形，杂交菌株的耳片长度除ZY1菌株在两亲本之间，其他菌株均小于两亲本，长度由大到小依次为ZP>ZY1>YS>ZY3>ZY2>ZY5>CK>ZY4，杂交菌株的耳片宽度均在亲本之间，未出现超亲现象。宽度由大到小依次为ZP>ZY1>ZY5>ZY3>CK>ZY2>ZY4>YS。

2.3 海南省生产试验

在海南省开展杂交菌株的生产试验统计结果，见图1。

生产试验发现杂交菌株与对照品种在生育期方面相似，而产量和泡发度方面相差较大，如图1所示，5个杂交菌株均适宜在海南省栽培，产量均超过对照品种，其中菌株ZP的1个单核菌株与菌株YS的3个单核菌株的杂交子ZY3、ZY1、ZY2分别比对照增产92.75%、75.36%、28.98%，说明菌株YS的3个单核菌株的产量特性方面YS-17>YS-1>YS-2；亲本菌株ZP的3个单核菌株与另一亲本菌株YS的一个单核菌株（YS-17） 的杂交子 ZY5、ZY3、ZY4，分别比对照增产 113.04%、92.75%、62.22%，说明菌株ZP的3个单核菌株的产量特性方面ZP-6>ZP-1>ZP-2，所以单核菌株YS-17与菌株ZP-6杂交而成的菌株ZY5的产量最高，高于对照品种113.04%。杂交菌株泡发度方面除了菌株ZY4小于对照，其余菌株均高于对照，其中ZY3>ZY1>ZY2，即在泡发度特性方面单核菌株YS-17>YS-1>YS-2；而由同一单核菌株YS-17与其他单核菌株杂交的菌株在泡发度方面ZY3>ZY5>ZY4，即菌株ZP的单核菌株在泡发度特性方面ZP-1>ZP-6>ZP-2，所以泡发度方面最高的是单核菌株YS-17与单核菌株ZP-1杂交而成的菌株ZP3，比对照品种高29.47%。

3 讨论

本试验中，颜色较浅的2个亲本菌株能杂交出深色品种，再次说明无论颜色多么浅，都属于有色类型，这与本团队关于毛木耳颜色遗传的报道结果相似[11]。

本研究的生产试验地点为海南省，在选择对照品种时，选择的为当地的主栽品种而不是杂交菌株的亲本是因为这样能够更好的体现杂交菌株在海南省的实际生产情况。当地食用菌产业起步晚、规模较小，很多品种也是由外地引入[12]。试验获得的杂交菌株比海南当地品种增产效果明显，可能是这些杂交品种确实优良，也可能因为当地引入的毛木耳品种尚不适应在海南栽培造成的。

杂交育种通常选择两亲本各10个单核菌株进行两两配对杂交[8]，这样选择的单核菌株较少且杂交配对组合较多，不能全面的选择最优的单核菌株。本试验在进行杂交时选择A菌株的1个单核菌株与B菌株的多个单核菌株分别杂交，筛选出B菌株的最优单核菌株，同时选择A菌株的多个单核菌株与B菌株的一个单核菌株分别杂交，筛选出A菌株的最优单核菌株，然后用A菌株的最优单核菌株与B菌株的最优单核菌丝进行杂交得到最优的杂交菌株[13]。该方法可以最大可能的筛选出优良组合，同时节省了杂交的时间，为食用菌杂交技术提供一个优质的方法。

耳片颜色、形状和大小是毛木耳重要的商品性状[14]，本文研究结果为毛木耳杂交育种提供了参考。同时，今后还要增加菌株数量，调查更多指标，进一步完善杂交菌株颜色遗传规律的探究。