灭菌温度对产腈水合酶菌发酵生产的影响
2022-03-30钟山金周建荣潘海祥周建春
钟山金 周建荣 潘海祥 周建春
江苏昌九农科化工有限公司 江苏 如东 226499
引言
腈水合酶（nitrile hydratase，NHase）是生物催化法生产丙烯酰胺（acrylamide，AM）的催化剂，能催化丙烯腈（acrylonitrile，AN）水合生成丙烯酰胺[1-2]。该菌的培养是微生物法生产丙烯酰胺的关键。在腈水合酶菌的发酵工业化生产中，发酵罐中的培养基需经过蒸汽消毒灭菌后才能接入菌种进行进一步发酵培养，而培养基的消毒灭菌温度成为关键，灭菌温度越高，灭菌越彻底，但同时培养基中的营养成分被破坏的越多[3]，培养基中的营养越少，腈水合酶菌发酵后的酶活越低；灭菌温度越低对培养基的破坏越小，腈水合酶菌发酵后的酶活越高，但是灭菌温度越低灭菌越不彻底，越容易染杂菌，染杂菌后腈水合酶菌发酵后酶活降低，酶活越低，发酵液的消耗量越高。生产实践中发酵液消耗量的高低直接影响丙烯酰胺生产的效益。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 产腈水合酶的菌。Nocardia.sp.163，为本实验室保藏。
1.1.2 培养基（g/L）葡萄糖20.0 ；K2HPO40.50；KH2PO40.50 ；MgSO4.7H2O0.50 ；谷氨酸1.0；尿素7.0；酵母膏6.0；CoCl2·6H2O，20mg/L，片碱0.5。以上培养基成分中K2HPO4、KH2PO4、MgSO4.7H2O和CoCl2·6H2O是分析纯，尿素及片碱为工业级，其余皆为食品级。
1.2 方法
1.2.1 种子罐种子液的发酵培养。将制备好的Nocardia.sp.163液体菌种接于已备好的种子罐进行发酵培养，温度为28℃，通气量40m3/h，培养44 h后降温至4～6℃，备用。
1.2.2 发酵罐培养基消毒灭菌温度的实验方法。在10吨发酵罐空罐灭菌后打开人孔，按配方投入水、葡萄糖，酵母膏，尿素，K2HPO4、KH2PO4、MgSO4.7H2O，味精，CoCl2·6H2O，片碱后，关闭人孔，从发酵罐夹套进蒸汽，待温度上升至90℃后，关闭夹套蒸汽，改由进气管。出料管，取样管进蒸汽继续升温，分别在120℃，119℃，118℃，117℃，116℃，115℃，114℃，113℃，112℃，111℃，110℃保压计时灭菌17分钟后，用冷却水降温至30℃，再通过管道接入备用好的种子罐种子液，在28℃，气量150m3/h，搅拌转速200转/分钟条件下培养42h后，放入发酵液储罐降温至4～6℃，离心机离心后同过微滤膜清洗至色度50以下；加水混合至原来离心的前的质量；备用
1.2.3 水合反应方法。在25m3的反应釜中投入15吨水，2.5吨上述备用的发酵液，连续流加丙烯腈（流量为0.9Th）至丙烯酰胺浓度为30%时，停止流加丙烯腈,反应过程中每小时取样一次测定水合釜中的丙烯腈含量，当丙烯腈含量≤0.1%，丙烯酰胺浓度为30%时，用超滤膜分离出丙烯酰胺溶液和发酵液，丙烯酰胺溶液放入丙烯酰胺反应液储罐一倍后一工序使用，发酵液回到反应釜中加入水至15.5吨位置后再次流加进行水合反应，直至水合釜中丙烯腈含量超过0.1%且丙烯酰胺含量＜30%时，适当降低丙烯腈流加量，至丙烯酰胺浓度到30%时，停止流加丙烯腈。待丙烯腈含量丙烯腈含量≤0.1%时，用超滤膜分离丙烯酰胺溶液和发酵液后，此2.5吨发酵液使用结束。
1.2.4 发酵液消耗量的计算方法。发酵液消耗量=发酵液用量/此发酵液产生的丙烯酰胺量，其中丙烯酰胺量按折百丙烯酰胺计算。
1.2.5 检测方法。
1.2.5.1 腈水合酶活性的测定。准确移取1mL发酵液，19mL磷酸缓冲液于150mL具塞三角瓶中，把三角瓶放入恒温水浴，开启振荡，温度恒定在28℃，加入1000μL AN，用秒表控制，准时反应5min，用4moL／L HCL200μL中止反应，用气相色谱仪测定反应液中生成的丙烯酰胺含量。
1.2.5.2 丙烯腈含量的测定。用5mL刻度离心管装5mL样品液，3000转/min离心15min后上清液倒入到干净的小瓶中，用气相色谱仪外标法测定反应液中丙烯腈含量。
1.2.5.3 镜检的测定。取发酵液直接涂布在载玻片上，干燥后用结晶紫溶液染色，待干燥后用纯水洗去染色液，干燥后滴一滴香波油，用2500倍油镜观察一个视野里的杂菌数，无杂菌为正常。
2 结果与分析
2.1 不同灭菌温度下腈水合酶活性及镜检的检测结果
不同灭菌温度下腈水合酶活性变化的检测结果见表1。
表1 不同灭菌温度下腈水合酶活性变化的检测结果
从表1中可以看出，灭菌温度的降低，发酵液酶活逐渐升高，说明腈水合酶活性与腈水合酶菌的培养基灭菌温度有关联，在119 ℃、118 ℃、117 ℃、116 ℃、115℃、114℃、113℃和112 ℃灭菌的培养基发酵培养所得到的腈水合酶活性平均酶活单位（万μ/mg）分别比对照正常120℃灭菌的培养基发酵所得的腈水合酶活性平均酶活单位分别提高了10%、15.6%、22.2%、38%、55%、67%、45%和31%。其中114℃灭菌培养基培养所得到的腈水合酶酶活单位为835万μ/mg，比Nocardia.sp.163菌株的120℃灭菌的培养基培养所得的腈水合酶酶活单位提高了67%。114℃以下灭菌的培养基培养所得到的发酵液出现不同程度的染杆菌现象，随着温度的降低杆菌由2个逐渐上升至20个。
2.2 不同灭菌温度下腈水合酶在水合釜中的反应结果
每罐发酵罐发酵后的发酵液为5吨，每个反应釜用发酵液2.5吨，一罐发酵液分2个反应釜进行反应。两罐发酵液使用4个反应釜进行水合反应。Nocardia.sp.163发酵培养基在不同温度下灭菌所得到的发酵液在水合反应中的发酵液消耗量结果见表2。
表2 Nocardia.sp.163发酵培养基在不同温度下灭菌的培养基发酵培养后的发酵液在水合反应中的发酵液消耗量结果
从表2可以看出，114℃灭菌的发酵培养基培养所得到的发酵液投入水合釜反应后的发酵液消耗量为0.0947T/TAM，比120℃灭菌的发酵培养基培养所得到的发酵液消耗量0.1389T/TAM相对低68%，即降低了32%的发酵液消耗量。
3 结束语
Nocardia.sp.163菌株发酵罐发酵培养基通过不同灭菌温度发酵所得到的发酵液检测发酵液中腈水合酶酶活性筛选，获得优良的114℃灭菌温度，腈水合酶酶活性达到835万μ/mg，比出发的120℃灭菌发酵培养所得到的腈水合酶酶活性500万μ/mg提高了67%。
通过不同灭菌温度发酵所得到的发酵液在水合反应釜中的发酵液消耗量计算，114℃灭菌的培养基发酵培养所得到的发酵液，其发酵液消耗量比120℃灭菌的培养基培养所得到的发酵液消耗量降低了32%。
