重组人脑钠肽对兔缺血再灌注后心室肌细胞L-钙离子通道电流的影响

丁超，郭洁，王冬梅，李洁，陈会校，孙家安

经皮冠状动脉介入治疗（PCI）技术带来的再灌注损伤，直接影响到患者的预后，特别是再灌注心律失常，是缺血再灌注期间患者猝死的最主要原因之一[1]。重组人脑钠肽（rhBNP）能够拮抗肾素－血管紧张素系统（RAS）和交感神经系统的激活，抑制心肌重塑[2,3]。

本研究采用全细胞膜片钳技术，研究rhBNP对缺血再灌注后兔心室肌细胞跨膜L－钙通道电流（ICa-L）的影响，探讨rhBNP拮抗再灌注心律失常的细胞学离子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康新西兰大耳白兔45只，雌雄不限，体重（2～2.5）Kg，由河北医科大学实验动物中心提供。随机分为3组（每组15只）：缺血再灌注组（I-R组），rhBNP治疗组（rhBNP组）和假手术对照组。

1.2 实验药物与溶液 实验药物：HEPES, EGTA, 4-aminopyridine（4-AP）, 胶原酶Ⅰ，氯化胆碱购自Sigama公司，余试剂均为国产分析纯。rhBNP（新活素，0.5mg/支，由成都诺迪康生物制药有限公司生产）。溶液：ICa-L电极外液：氯化胆碱 120 mmol/L，CsOH 4 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用CsOH调节pH至7.3。加入4-AP 5 mmol/L、CsCl 20 mmol/L以阻断钾电流。ICa-L电极内液：CsCl 80 mmol/L，MgCl22 mmol/L，ATPNa2 5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，用CsOH调节pH至7.3。

1.3 心肌缺血再灌注动物模型建立 采用2.5%硫喷妥钠1.0ml/kg耳缘静脉麻醉，利用针刺电极插入动物四肢皮下记录肢导心电图。剪开心包膜后，在左心耳下2mm，分离左冠状动脉前降支，用3/8圆2.5×8mm不锈钢圆针，带6-0丝线穿过心肌浅层，丝线穿过一塑料管，拉紧塑料管两端丝线，使塑料管压迫冠状动脉造成心肌缺血，30 min后，放松结扎线后行心肌再灌注120 min。其中假手术对照组开胸后仅分离左冠状动脉前降支并穿线而不结扎，以排除开胸手术对心肌细胞电生理参数的影响。在缺血再灌注模型开始后，rhBNP组动物耳缘静脉注射rhBNP 0.06μg/（kg.min）（持续30 min），I-R组和对照组动物由耳缘静脉注射相同剂量的生理盐水。

1.4 心律失常评分标准 采用心电监护仪进行监测。心律失常诊断标准按照Lambeth会议标准，评分则采用Curtis-Walker评分规则[4]，对心律失常严重程度进行定量分析。具体如下：①0分：无心律失常；②1分：偶发性室性早搏（指1min内发生3次以下的室性早搏）；③2分：频发性室性早搏（指1min内发生3次或3次以上的室性早搏）；④3分：偶发性室速（指1min内发生3次以下的室速）；⑤4分：频发性室速（指1min内发生3次或3次以上的室速）或偶发性室颤（指1min内发生3次以下的室颤）；⑥5分：频发性室颤（指1min内发生3次或3次以上的室颤）或死亡。

1.5 细胞分离 采用酶解（胶原酶I 0.4mg/ml，Sigma公司）的方法分离单个心室肌细胞[5]。细胞来源于心脏冠状动脉左前降支毗邻的左心室前壁梗死区部位，特征为此梗死区外膜变为白色斑片状；对照组细胞则取自左心室前壁与梗死区相对应的部位。

1.6 膜片钳全细胞记录 按Hamill法[6]进行，脉冲信号由pulse+pulsefit软件（HEKA，version 8.53）控制，通道信号经EPC-9膜片钳放大器（HEKA，德国）放大，通过Ag-AgCl电极丝和填充电极内液的微电极导入细胞，产生的电流信号经EPC-9转换，为pulse+pulsefit软件收集、分析。各电流幅值除以细胞膜电容所得即为电流密度，以不同钳制电压下的电流密度绘成电流—电压关系（I-V）曲线。所有实验在室温（25℃）下进行。

2 结果

2.1 rhBNP对缺血再灌注中心律失常的影响 对照组仅出现偶发室性早搏，I-R组室速和室颤发生率明显增加，心律失常评分明显增加（P＜0.01）；与I-R组相比，rhBNP组室速和室颤发生率下降，心律失常评分降低（P ＜0.05）。

2.2 rhBNP对缺血再灌注后心肌细胞ICa-L的影响 从维持电位（Holding potential，HP）-50 mV开始，阶跃+10 mV，逐步去极化到+40 mV，时程250 ms。以不同钳制电压下的ICa-L电流强度绘成I-V曲线。均在-40 mV激活，0 mV达峰值，+50 mV时反转。I-R组与对照组相比，I-V曲线上移；rhBNP组与I-R组相比，I-V曲线下移，接近对照组。但ICa-L电压依赖性不变，对激活电位、峰值电位、反转电位及I-V曲线的形态轨迹均无影响（图1）。

表1 三组心律失常的发生情况及心律失常评分

图1 rhBNP对缺血心肌细胞ICa-LI-V曲线的影响

3 讨论

再灌注心律失常是指缺血心肌的部分或全部在血流灌注恢复的过程中所发生的心律失常，进而导致患者血液动力学改变，是缺血再灌注期患者猝死的重要原因之一，约占80%[1]。抗心律失常药物传统作用靶点是直接阻断某一离子通道，但这些药物对病变心脏的室性快速心律失常的疗效不佳且有负性效应，特别是心律失常抑制试验（CAST）中，应用钠通道阻断剂氟卡胺及恩卡胺治疗急性心肌梗死（AMI）后室性心律失常，增加了死亡率，引发了对传统抗心律失常药物致心律失常副作用的担忧。

脑钠肽（BNP）是一种主要由心室肌分泌的激素，国外基础及临床研究结果表明，BNP可扩张机体动静脉血管，降低肺及外周血管阻力，提高心输出量，降低容量负荷，并可拮抗继发性的RAS系统和交感神经系统的激活[2,7]，对抗毒性作用，减少心肌梗死面积[8]，改善患者的临床和血液动力学指标[9]。rhBNP是一种应用生物重组技术生产的、与人类内源性BNP等同的肽类物质，已在2001年被美国食品及药品管理署（FDA）批准应用于临床治疗急性失代偿性心衰。

再灌注心律失常的发生机理尚不完全明确，钙超载可能是原因之一。本研究发现，rhBNP可降低心肌缺血再灌注期间心律失常的发生率。心肌缺血再灌注后，ICa-L明显增高，rhBNP可使上升的ICa-L下调，逆转电重构，可能为rhBNP降低心律失常发生率的细胞学离子机制。rhBNP可能通过两条途径发挥抗心律失常作用：一方面通过钙拮抗作用，提高室颤阈，增加细胞膜的稳定性；另一方面通过拮抗RAS系统和内皮素活性、抑制交感神经兴奋性，改善血液动力学指标，修复心室肌细胞离子通道的损伤而发挥抗心律失常作用。心肌细胞膜上的离子通道本来是有序的，病变心肌多离子通道的改变使动作电位缩短或延长，导致心律失常。由于动作电位的长度与膜复极化过程总的离子流相关，单纯阻断某一离子通道的药物难以发挥理想的作用。所以，有效的抗心律失常药物的新靶点应以降低离子通道的损伤为楔入点，改变离子通道的环境尤为重要。

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