阴虚血亏大鼠模型血管活性肠肽表达及心肌超微结构的改变

李 浩

心血管调节肽广泛分布于中枢神经系统和心血管系统，是一个非常复杂、非常庞大的神经体液调节网络。从这些生物活性物质的分布和作用来看，中枢神经系统和心血管系统之间的功能关系密切。血管活性肠肽（vasoacitve intestinal peptide，VIP）对循环系统具有扩张血管、降低血压、增加心率、增强心肌收缩力和舒张冠脉血管的作用［1］，与其受体垂体腺苷酸环化酶激活肽特异性结合，还具有抑制心肌成纤维细胞增殖的作用，与多种心血管疾病密切相关，如高血压病、心肌病、心力衰竭等。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性SD大鼠20只，体重200g±20g，由华中科技大学同济医学院提供，批号：00002829。随机分为空白对照组、模型组，每组10只。实验前将各组大鼠放在同一笼中适应饲养2周，自由摄食、饮水。室温和水温均控制在22℃～24℃。

1.2 试剂及药物 D-半乳糖：上海试剂二厂生产，批号为070124；咖啡因：购自美国Sigma公司；VIP抗兔／鼠通用型免疫组化试剂盒，购自 Gene tech company limited，货号为GK500705；其他如10%水合氯醛、2.5%戊二醛、10%多聚甲醛、1%四氧化锇等为市售常用试剂。

1.3 仪器 日立H-600型透射电镜（日本日立公司），LKB-V型超薄切片机（瑞典BROMMA公司）。

1.4 方法

1.4.1 阴亏血虚大鼠模型的建立 参照文献［2］方法制作阴亏血虚大鼠模型，模型组按60mg／（kg·d）标准颈背部皮下注射D-半乳糖4周，按30mg／（kg·d）标准腹腔注射咖啡因1周，空白对照组常规饲养。所用动物给药时间均为每晚18：00。

1.4.2 免疫组化法测定模型大鼠心脏VIP 各组大鼠处理完毕，用10%水合氯醛0.3mL／100g麻醉大鼠，处死大鼠。迅速打开胸腔摘取心脏，置4℃预冷匀浆介质中洗去残血。由右室游离壁沿心脏长轴切开，取小块心肌用10%多聚甲醛溶液固定48h以上，自来水冲洗48h，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋。以4%多聚甲醛溶液300mL灌注约30min内固定。取脑，放入4%多聚甲醛溶液中固定48h。自来水冲洗12 h，经70%、80%、95%酒精梯度脱水各12h，正丁醇脱水6h。取出组织，低温（60℃）浸蜡过夜，包埋、连续切片，片厚4μm，切片每隔3张取1张。

石蜡切片置于65℃烘箱中，烘片2h，用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次5min；EDTA微波修复；自然冷却后PBS（pH7.4）洗3次，每次5min；切片放入3%过氧化氢溶液，室温下孵育15 min；PBS（pH7.4）洗3次，每次5min；甩去 PBS液，加第一抗体；每张切片加入约50μL稀释液，4℃过夜；PBS（pH7.4）洗3次，每次5min；甩去PBS液，每张切片加50μL～100μL新鲜配制的DAB溶液，显微镜控制显色；显色完全后，蒸馏水冲洗，苏木素复染，1%盐酸酒精分化1min，自来水冲洗，氨水返蓝1 min，流水冲洗；切片经过梯度酒精70%、80%、95%脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

图像采集每组取8份标本，各随机取5个视野，显微镜下观察，采用HPIAS-1000多媒体彩色病理图文分析系统，对免疫组化VIP阳性细胞（胞体完整，染色呈棕色或深棕色）进行计数。

1.4.3 心肌组织电镜标本的制备 如前各组大鼠处理完毕，取小块心肌用2.5%戊二醛前固定24h，0.1mol／L磷酸缓冲液漂洗3次，锇酸（OsO41%）后固定24h，0.1mol／L磷酸缓冲液漂洗3次，梯度酒精脱水（50%、70%、80%、95%、100%二次）每次15min，纯丙酮脱水二次（15min），EPON812：丙酮（1∶1）浸透30min，纯包埋液浸透1h，纯包埋液固化37℃24h后60℃48 h，切片机切片，醋酸双氧铀、枸橼酸铅染色，透射电镜观察。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0软件包进行统计分析。

2 结 果

2.1 大鼠VIP水平实验结果（见表1）

表1 天王补心丹对大鼠血浆VIP水平的影响（x±s）

2.2 心肌组织透射电镜下超微结构的改变 空白对照组心肌细胞核大，肌原纤维清晰规整，横纹清楚，肌节无皱缩；胞质内肌浆网正常，无管壁溶解；线粒体排列整齐，内、外膜完整，基质密度适中，线粒体嵴完整，排列整齐。模型组大鼠心肌组织的改变有：心肌肌丝排列紊乱、断裂，肌小节排列紊乱、断裂；大部分心肌细胞核结构正常，少数细胞核可见浓缩变小，染色质轻度溶解及凝聚，核膜皱缩尚完整；大部分线粒体形成高电子密度状，内、外膜及嵴结构模糊，不清晰；肌浆网囊性扩张，成大囊泡状，部分肌浆网破裂。

3 讨 论

近年来，关于VIP和心血管系统关系的研究越来越多。心脏及血管活动受神经、体液等多种因素调控，VIP是重要的肽类神经递质之一，其在心血管系统中也有着广泛的分布，对心脏血管活动有重要的调节作用。现代研究证明，VIP通过结合VIPC1、VIPC2、PAC1特异性受体，激活cAMP依赖蛋白激酶A（PKA），cGMP依赖蛋白激酶G（PKG）等多种途径起到调节血管的作用［3-5］。同时，VIP对心脏活动也有着重要的调节作用。有实验证明VIP可以加快心率［6］。并在心力衰竭的发病发展过程中起着重要作用。其作用机制与VIP参与恢复血液动力平衡、提高心肌功能、对抗其他神经内分泌系统如肾素-血管紧张素系统激活引起的副反应有关［7，8］。

本实验研究结果显示，模型组VIP含量显著升高，而同时心肌结构受到损害，电镜观察心肌的超微结构显示心肌肌丝排列紊乱、断裂，少数细胞核可见浓缩变小，染色质轻度溶解及凝聚，核膜皱缩，线粒体形成高电子密度状，嵴结构模糊，不清晰，肌浆网囊性扩张，成大囊泡状，部分肌浆网破裂。VIP作为参与心衰发生发展的重要体液因子，提示模型组大鼠可能已经出现心功能不全。而VIP可能参与了心肌结构损害的过程。

［1］ DvorákováMC.Cardioprotective role of the VIP signaling system［J］.Timely Top Med Cardiovasc Dis，2005，3（9）：E33.

［2］ 黄攀攀，王平，李贵海，等.老年阴虚失眠动物模型的建立与评价［J］.中华中医药学刊，2010，28（8）：1719-1723.

［3］ Pasyk E，Mao YK，Abroad S，et al.A endothelial cell-line rontains functional vasoactive intestinal poly-peptide receptors：They control inwardly rectifying K＋channels［J］.Eur J Pharmacol，1992，212（2-3）：209-214.

［4］ White CM，Ji S，Cai H，et al.Therapeutic potential of vasoactive intestinal peptide and its receptors in neurological disorders［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets，2010，9（5）：661-666.

［5］ Keef KD，Shutt leworth CW，Xue C，et al.Relationship between nitric oxide and vasoactive intestinal popypetidein in enteric inhibitory neurotransmission［J］.Neuropharmacology，1994，33（11）：1303-1317.

［6］ Kuncova J，Faitova S，Capouch J，et al.Chronic atropine administration diminishes the contribution of vasoactive intestinal polypeptide to heart rate regulation［J］.Physiol Res，2008，57（6）：827-829.

［7］ Lucia P，Caiola S，Coppola A，et al.Vasoactive intestinal peptide（VIP）：A new neuroendocrine marker of clinical progression in chronic heart failure［J］.Clin Endocrinol（Oxf），2003，59（6）：723-727.

［8］ Kupari M，Mikkola TS，Turto H，et al.Vasoactive intestinal peptide release from the heart and response in heart failure due to left ventricular pressure overload［J］.Eur J Heart Fail，2006，8（4）：361-365.