体外循环犬单肺缺血再灌注损伤模型的建立

游 露，陈 松，王 勇，李姗姗，窦雪娇，张 红

(遵义医学院附属医院 麻醉科，贵州 遵义563099)

体外循环犬单肺缺血再灌注损伤模型的建立

游 露，陈 松，王 勇，李姗姗，窦雪娇，张 红

(遵义医学院附属医院 麻醉科，贵州 遵义563099)

目的建立体外循环单肺缺血再灌注损伤动物模型。方法6只健康杂种犬阻断左肺动脉，终止左肺血供及通气，造成左肺缺血，并循体外循环60 min后开放左肺动脉，恢复左肺血供及通气形成再灌注损伤，左肺再灌注2.5 h后结束实验，右肺全程维持血供及通气。于CPB前(T1)、阻断左肺动脉并循60 min(T2)、再灌注2.5 h(T3)三个时间点观察肺组织病理学变化并进行评分，对比肺动态顺应性(CD)、氧和指数(OI)、呼吸指数(RI)变化比例。结果①病理学变化：CPB后左、右肺组织见大量炎性细胞浸润，肺泡间隔增宽，肺泡壁断裂甚至坏死；左肺病理改变较右肺严重；②病理切片评分：CPB后左、右肺病理评分逐渐升高；T1时点左、右肺组织评分无差异，T2、T3时点左肺评分明显高于右肺；③CD、OI、RI变化比例：CPB后CD、OI明显下降，RI明显升高；左肺CD、OI下降程度、RI升高程度较右肺明显。结论本实验动物模型建立成功，能全面地模拟临床心脏手术过程，对CPB肺保护相关研究有着积极的推动作用。

体外循环；单肺缺血再灌注损伤；动物模型；犬

肺保护一直是体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)心脏外科手术研究的热点，临床研究的风险性较高，多数研究的实施依赖于动物模型。因此，简单、易行的动物模型对CPB肺保护的研究有着重要的意义。传统的心脏停跳模型[1-2]，因心脏停跳往往对动物损伤较大，多数动物(尤其是小动物)不能耐受，影响实验的进一步实施，远期肺损伤得不到研究；心脏不停跳模型[3-4]，虽然提高了动物的耐受性，但仅能模拟体外非生理循环状态，不能体现缺血再灌注损伤。为此，本实验的目的是建立既能模拟体外心脏手术过程又能提高动物耐受性，在心脏不停跳的基础上建立单肺(左肺)缺血再灌注损伤模型，为体外循环肺保护提供新的研究手段。

1 材料与方法

1.1 实验准备 健康成年杂种犬6只，体重10～15 kg，雌雄不拘，由遵义医学院动物实验中心提供。动物用2.5%戊巴比妥25 mg/kg，腹腔内注射麻醉，仰卧位固定于手术台，行双腔气管插管(根据需要实施单侧通气)，监护ECG、测舌粘膜氧饱和度(SmO2)等，分别于右侧股动、静脉置管监测动态平均动脉压(MAP)及中心静脉压(CVP)，测量直肠温度，术中间断给予戊巴比妥钠维持麻醉。用羟乙基淀粉300 mL及乳酸钠林格氏液100 mL充CPB管道，排气后备用。

1.2 手术操作 开胸前，给肌松药，调节呼吸机潮气量12～15 mL/kg，呼吸频率16次/min，I:E=1:2，FiO2=99%，接麻醉机行机械通气。正中劈开胸骨，操作时避开大血管，进入胸腔后切开心包暴露心脏；游离左侧肺动脉及右侧肺动脉，分离右侧动脉时，由于犬的右肺动脉位置较深，需要将心脏整个翻起，操作时尽量轻柔、快速，避免损伤，若出现循环不稳定，停止操作，待犬循环稳定后进行下一步操作。右心房内注入肝素3 mg/kg，肝素化后分别行升主动脉和右心房插管，连接人工心肺机及CPB管道；待ACT>480 s后开始CPB开始转流，阻断左肺动脉，调整双腔气管导管行右侧单肺通气(以直视左侧肺部完全塌陷，右肺单肺通气为标准)，并行循环60 min后开放左肺动脉，恢复左肺血液灌注及机械通气，30 min内逐渐停止CPB，停机时用鱼精蛋白(1∶1.5)中和肝素，机血回收后回输入犬体内，再灌注2.5 h后实验结束。术中根据情况适当应用肾上腺素或硝普钠股静脉泵入，维持循环的稳定。在此过程中，通过动脉血气分析来调整酸碱及电解质平衡。实验犬均采用浅低温CPB，维持MAP在60～80 mmHg，CVP在5～12 cmH2O，灌注流量在100～120 mL/kg/min。

1.3 标本采集及指标检测

1.3.1 病理学变化 分别于CPB前(T1)、阻断左肺动脉并循60 min(T2)、再灌注2.5 h后(T3)各时点取左、右肺组织，T1时点取上叶肺尖，T2时点取中叶肺尖，T3时点取下叶肺尖，约为1 cm×1 cm，用10%福尔马林固定，石蜡切片(5 μm)，HE染色，光镜下观察肺组织病理变化。

1.3.2 病理切片评分 根据改良的Mayer等[5-6]标准进行病理评分，每张病理切片随机选择3个高倍镜视野分别进行评分，取平均值作为此切片的评分。

1.3.3 肺功能变化比例 于体外循环转机前，短暂阻断一侧肺动脉，并调整潮气量行对侧单肺通气，使循环血流及机械通气量完全通过单侧肺动脉及支气管，分别获得左、右肺功能指标的基础值：①肺动态肺顺应性(pulmonary dynamic compliance，CD)，CD= V/P，V=潮气量，P=气道峰压-呼气末正压，测量时动物充分镇静；②氧合指数(oxygenation index，OI)，OI=PaO2/ FiO2。T1、T3时点取股动脉血1 mL，行动脉血气分析(T2时点左肺无血供及通气，故无血气分析)检测血氧分压(PaO2)，PaO2与吸入氧浓度(FiO2)之比即为血氧和指数；③呼吸指数(respiration index，RI) ，RI=P(A-a)O2/ PaO2，P(A-a)O2(肺泡-动脉血氧分压差)= (Pa-PH2O)FiO2-PaO2-PaCO2，P为大气压，标准状态下为760 mmHg，PH2O为饱和水蒸气压，标准状态下为47 mmHg，FiO2(%)为99%的吸入氧浓度。

左肺再灌注2.5 h后，根据上述方法，分别测定左、右肺CD 、OI 、RI。计算相应左、右肺功能的变化比例= (再灌注后值-基础值) /基础值。

2 结果

2.1 一般资料 实验动物体重、体表面积、前并循时间、左肺动脉阻断时间、后并循时间、CPB时间、灌注液体积以及最低鼻咽温等比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 肺组织病理变化 T1时点各组肺组织结构清晰，肺组织结构正常。T2时点：右肺肺泡腔内出现少量水肿液及较多炎性细胞浸润；左肺组织结构均紊乱，大量炎性细胞浸润，肺间质及肺泡内见大量水肿液(见图1)。T3时点：右肺肺泡毛细血管扩张，肺间质见大量水肿液及炎性细胞；左肺病理损伤较右肺严重，肺组织结构紊乱，肺间隔明显增宽，肺间质见大量水肿液，肺泡壁断裂，肺泡腔塌陷，甚至可见部分肺泡壁坏死断裂，红细胞漏出(见图3)。

注：A：右肺组织结构清晰，肺泡腔内出现少量水肿液及炎性细胞浸润；B：左肺组织结构紊乱，部分肺泡腔塌陷，肺泡内及间质出现水肿液及大量炎性细胞浸。 图1 T2时点肺组织HE染色×400

注：C:右肺组织结构紊乱，肺泡腔塌陷，肺泡腔内见大量渗出液及炎性细胞;D:左肺组织结构紊乱，大量肺泡腔塌陷，肺泡壁坏死断裂，肺泡内见大量水肿液和炎性细胞，红细胞浸润。 图2 T3时刻肺组织HE染色×400

2.3 肺组织病理切片评分 CPB前左、右肺组织无明显差异(P>0.05)；CPB后左、右肺各时点较CPB前评分逐渐升高(P<0.05)；T2、T3时点左肺病理评分明显高于右肺(P<0.05，见表1)。

肺组织T1T2T3左肺0.24±0.073.73±0.30*6.03±0.22*#右肺0.21±0.073.27±0.24*△4.55±0.35*#△

注：与T1比较，*P<0.05 ；与T2比较，#P<0.05；与左肺比较，△P<0.05。

2.4 左、右肺肺功能的变化比例 利用血气结果计算CD、OI 、RI及相应肺功能变化比例。再灌注2.5h后，左、右肺功能与基础值比较均有不同程度的恶化。左肺CD、OI下降程度及RI增加程度比右肺明显增加(P<0.05,见表2)。

肺组织CD减少比例OI减少比例RI增加比例左肺0.71±0.060.80±0.0516.53±7.74右肺0.43±0.02*0.66±0.07*7.33±5.10*

注:与左肺比较，*P<0.05。

3 讨论

CPB期间血液成分与人工管道的接触、中性粒细胞的释放与聚集、内毒素的释放等均可引起机体复杂的炎症反应，这种炎症反应是引发全身系统性炎症反应的重要原因；肺循环及呼吸机停止，使肺组织处于缺血、缺氧状态，造成肺缺血性损害，肺组织细胞骨架及线粒体破坏严重；当开放肺动脉后，大量血液及氧气进入肺循环造成肺再灌注损伤，导致肺功能严重下降[7-8]。可见，全身系统性炎症反应及缺血再灌注损伤是导致CPB肺损伤的两大主要因素。

根据体外循环肺损伤的特点建立CPB单肺(左肺)缺血再灌注损伤模型，在全程转机的同时阻断左肺动脉，模拟临床心脏直视手术阻断升主动脉心脏停跳过程中肺组织的缺血状态；开放左肺动脉模拟CPB心脏复跳后肺组织再灌注损伤。与临床实际操作不同，实验动物心脏并不停跳，减少了动物的创伤，使实验动物能够长时间的保持循环稳定(左肺再灌注后能维持生命体征平稳超过2.5 h)。心脏不停跳的情况下全程并行循环，排出心脏因缺血再灌注对肺功能的干扰。在既有的CPB单肺肺损伤模型[9]基础上进行改良，简化了分离左肺静脉，减少了操作步骤，更简单易行，提高了实验的成功率。为了平衡左、右肺的差异，分别测量左、右肺基础值(选择体外循环建管之后，转流之前的测量值为肺功能基础值)，通过对比再灌注后2.5 h左、右肺功能的变化的比例，来代替实测值判断双侧肺功能损伤的程度。

实验结果显示：CPB前左、右肺组织结构清晰，肺泡间隔无明显增宽，肺泡腔未见填充物；CPB后左、右肺组织损伤逐渐加重，出现肺泡间隔增宽，大量炎性细胞浸润，肺泡腔内及肺间质见大量水肿液；同时肺组织病理切片评分也逐渐升高；再灌注2.5 h后，左肺较右肺肺组织损伤更严重；左肺比右肺同时点病理评分明显增高(P<0.05)。说明：CPB可导致肺组织结构的病理改变；左肺由于遭受全身炎症反应与缺血再灌注的双重打击，与右肺比较，左肺损伤更严重。提示，左肺缺血再灌注损伤建立成功。

CD、OI、RI是公认的反应肺功能的指标[10]，通过对比CD、OI、RI肺功能变化比例来判断肺功能损伤的程度。本实验结果：与基础值相比左、右肺功能均有不同程度的恶化；与右肺比较，左肺CD、OI、RI的恶化程度均明显增加(P<0.05)，左肺肺损伤程度明显重于右肺。说明：左肺在非生理性循环的基础上，又遭受了缺血再灌注损伤，使肺功能进一步恶化。

综上所述，CPB单肺缺血再灌注损伤模型建立成功，实验犬左肺能够同时反映CPB非生理循环及缺血再灌注的双重打击，充分模拟临床心脏手术过程。本模型适用于体外循环肺损伤及其机制的实验研究，有助于体外循环肺保护的发展。

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Establishmentofdoglungischemia-reperfusioninjuryofcardiopulmonarybypassmodel

Youlu,Chensong,Wangyong,Lishanshan,Douxuejiao,Zhanghong

(Department of Anesthesiology,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo establish a single lung ischemia-reperfusion injury of cardiopulmonary bypass (CPB) animal model in dog.MethodsSix healthy mongrel dogs was established the CPB mode, at the same time, the left pulmonary artery was clamping on; termination of the left lung blood supply and ventilation cause left lung ischemia,and left pulmonary artery was opened at 60 minutes. Restore left lung blood supply and ventilation formed reperfusion injury. The experiment was finished after reperfusion 2.5 h. Before CPB (T1), blocking the left pulmonary artery and through 60 min (T2), reperfusion 2.5 h (T3) three time points pathological changes of lung tissue and score Compare with left and right lung function change of pulmonary dynamic compliance (CD), and oxygen index (OI), respiratory index (RI) after reperfusion 2.5 h.Results①After CPB,left and right lung pathological structures was deteriorated to varying degrees; the left lung tissue structural disorder , alveolar wall rupture and necrosis , inflammatory cells and red blood cell was leakage , pathological damage was severe than the right lung after reperfusion 2.5 h.②Pathological section score of lung tissue: After CPB , compared with CPB before the scores gradually increased at each time point; the left lung score was significantly higher than the right lung in reperfusion 2.5 h.③The deterioration of the left lung of CD,OI,RI was significantly increased than the rigt lung after reperfusion 2.5h.ConclusionThe experimental animal model was successfully established, and comprehensively simulate lung injury factors in the process of clinical cardiopulmonary bypass . CPB lung protection related research was promoted.

Cardiopulmonary bypass; ischemia-reperfusion injury of lung; animal model; dog

贵州省科技厅联合基金资金资助(NO:黔科合J字LKZ[2012]05)。

张红,女,教授,硕士生导师,研究方向:体外循环肺保护，E-mail:hianzhang@tom.com。

R332

A

1000-2715(2013)05-0437-04

[收稿2013-05-21;修回2013-09-13]

(编辑：谭秀荣)