响应面法优化类脂囊泡包埋辣椒红色素的研究

李 贤，武彦文，欧阳杰，*

（1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系，北京 100083；

2.林业食品加工与安全北京市重点实验室（北京林业大学），北京 100083；

3.北京市理化分析测试中心，北京 100089)

响应面法优化类脂囊泡包埋辣椒红色素的研究

李 贤1，2，武彦文3，欧阳杰1，2，*

（1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系，北京 100083；

2.林业食品加工与安全北京市重点实验室（北京林业大学），北京 100083；

3.北京市理化分析测试中心，北京 100089)

通过单因素实验研究了辣椒红色素类脂囊泡制备过程中影响包封率的因素，并且利用响应面分析法优化了制备条件。结果表明，辣椒红色素的加入量、超声时间和囊泡类型是影响包封率的主要因素，其中辣椒红色素的加入量和超声时间对包封率的影响显著。包封率较高的制备工艺条件为：辣椒红色素添加量0.05g、胆固醇0.2g、HLB=8.2的复配表面活性剂0.4g（司盘80=0.27g，吐温20=0.13g）、超声时间24min。在此条件下类脂囊泡的包封率为82.4%，误差2.3%，重复性较好。

类脂囊泡，辣椒红色素，响应面分析

辣椒红色素是由茄科红辣椒的果皮中得到的一种橙黄或橙红色的天然红色素，属于类胡萝卜素类共轭多烯烃含氧衍生物，主要成分为辣椒红素和辣椒玉红素[1]。辣椒红色素主要用于糕点、冰淇淋、饼干、糖果和熟肉制品等食品的着色[2]。辣椒红色素的稳定性主要受温度、pH、热、光等因素的影响[3－4]，其中光对它的稳定性影响较大[5－6]。此外，辣椒红素在有氧条件下易发生氧化反应，设法增强辣椒红色素的稳定性以及对外界不良影响的抵抗能力是能否得到更广泛应用的关键[7]。

类脂囊泡由非离子型表面活性剂自组装形成，适量加入尿素等盐类物质可以促进囊泡的自发形成[8]。类脂囊泡具有闭合的双分子膜结构，又称非离子表面活性剂囊泡。结构上分为单室囊泡和多室囊泡两大类，粒径在30～1000nm之间，物理性质与脂质体相似[9]。类脂囊泡具有良好的稳定性和生物相容性，无毒、无免疫原性，亲水亲脂药物都能包裹，还可以对其表面进行修饰来制备特殊用途的囊泡[10]，前体类脂囊泡在储藏中更稳定[11]。因此，类脂囊泡可以提高被包埋物质的稳定性，有效控制被包埋物质的释放，延长缓释作用时间[12]。此外，与脂质体相比，非离子表面活性剂囊泡的载体材料不含磷脂，避免了磷脂的氧化降解，生产和贮存皆不需特殊条件，可使工艺简化、成本降低，是一种极有希望的新型药物载体[13]。本研究利用类脂囊泡技术来包埋辣椒红色素，以提高其稳定性，扩大在食品中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

辣椒红色素 北京金晔生物工程有限公司；司盘80、吐温20、胆固醇 食品级，含量95%；氯仿、乙醇、正己烷等化学试剂 均为分析纯。

冷冻离心机Biofuge Primo 德国Heraeus公司；752紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.2 类脂囊泡的制备方法

称取胆固醇0.2g和一定量的辣椒红色素，再称取0.4g不同HLB值的由司盘和吐温复配的表面活性剂，放入梨形烧瓶中，加20mL体积为比4∶1的氯仿/乙醇有机溶剂，混合至完全溶解[14]。将梨形烧瓶放入45℃水浴中，用旋转蒸发减压蒸发除去有机溶剂至成膜。将一定量的0.1mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液加入梨形烧瓶中，旋转振摇水化脂质干膜，超声处理一定时间，使贴壁的所有类脂囊泡从壁上脱落，形成均匀液体，即得类脂囊泡悬浮液。

1.3 类脂囊泡包封率的测定方法

式中，Q：包封率（%）；C：未被包埋的色素浓度（mg/mL）；V：正己烷体积（mL）；m：投入的总色素量（mg）。

将制得的类脂囊泡悬浮液以8000r/min于4℃离心10min，再取上清液过0.45μm的滤膜抽滤，在滤液中加入正己烷和乙醇萃取至无色，分液后取正己烷萃取液于460nm下测定吸光度值。由标准曲线得到的公式：浓度[c（mg/mL）]=[吸光度值（A460nm）+0.0039]/ 13.966计算得出未被包埋的色素浓度（c），并计算出包封率[15]：

1.4 单因素实验设计

以囊泡的包封率为指标，按照1.2的实验方法制备类脂囊泡悬浮液，以表面活性剂HLB值、辣椒红色素加入量、超声时间为单因素进行探索实验，并按1.3的实验方法测定类脂囊泡的包封率，分别确定三个单因素的最适反应条件。

1.4.1 表面活性剂HLB值对包封率影响的单因素实验 取0.4g由司盘80和吐温20复配的不同HLB值的表面活性剂、0.2g胆固醇、0.06g辣椒红色素、20mL氯仿/乙醇溶剂，混合溶解完全。将混合液旋转蒸发至成膜，再加入磷酸盐缓冲液旋转振摇水化干膜，同时超声处理10min，测定不同类型的囊泡对包封率的影响。复配的表面活性剂的HLB计算公式为：HLB= HLBi×Wi+HLBii×（1－Wi），i为司盘80，ii为吐温20，Wi为司盘80所占的比例。表面活性剂HLB值复配方案见表1。

表1 表面活性剂HLB值配方Table 1 Ingredient of HLB of surfactant

1.4.2 辣椒红色素加入量对包封率影响的单因素实验 取0.4g HLB值为8.4的复配乳化剂、0.2g胆固醇、20mL氯仿/乙醇溶剂，加入的辣椒红色素分别为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06g。分别将混合液旋转蒸发至成膜，再加入磷酸盐缓冲液旋转振摇水化干膜，同时超声处理10min，考察不同辣椒红色素加入量对包封率的影响。

1.4.3 超声时间对包封率影响的单因素实验 取0.4g HLB值为8.4的复配乳化剂、0.2g胆固醇、0.04g辣椒红色素、20mL氯仿/乙醇溶剂，将混合液旋转蒸发至成膜，再加入磷酸盐缓冲液旋转振摇水化干膜，制备的悬浊液五等分，分别超声处理10、15、20、25、30min，考察不同超声时间对包封率的影响。

1.5 响应面实验设计

在单因素研究的基础上，选取表面活性剂HLB值、辣椒红色素加入量、超声时间为自变量，囊泡的包封率为响应值，根据中心组合设计原理，响应面分析实验，其因素水平编码表见表2。

表2 响应面实验因素设计Table 2 Factor design of response surface experiment

2 结果与讨论

2.1 类脂囊泡包埋辣椒红色素的单因素实验

2.1.1 表面活性剂HLB值对包封率的影响 由图1可知，不同HLB值的类脂囊泡对辣椒红色素的包封率不同，当HLB值小于8.4时，随着HLB值的增加，包封率逐渐升高。当HLB值为8.4时，包封率达到最大值，HLB＞8.4时，随着HLB值的增加，包封率降低。表

图1 表面活性剂HLB值对包封率的影响

Fig.1 Effect of HLB of surfactant on the encapsulation efficiency of niosomes面活性剂的HLB值是表面活性剂的亲水亲油平衡值，即表面活性剂亲水能力与亲油能力的比值。适当的HLB值可以使表面活性剂分子更好的在辣椒红色素和水溶液的界面上排列，形成包封率高的囊泡，这与表面活性剂在水相和油相之间的界面张力有关，与辣椒红色素的油溶性相关。当HLB值为8.4时，表面活性剂在辣椒红色素表面的吸附量最大，因此包封率最高。当HLB值大于8.4时，表面活性剂亲水性逐渐变强，界面张力变大，因此包封率降低。

2.1.2 辣椒红色素加入量对包封率的影响 由图2可得知，辣椒红色素的加入量对包封率有影响。当加入量小于0.04g时，包封率随加入量增加而增大，可能是由于加入辣椒红色素的量未达到类脂囊泡包封的饱和度；加入量大于0.04g时，包封率随加入量增加反而减小，可能是由于囊泡已饱和，导致包封率下降。加入量为0.04g时包封率达到最大值。

图2 辣椒红色素加入量对包封率的影响Fig.2 Effect of paprika red content on the encapsulation efficiency of niosomes

2.1.3 超声时间对包封率的影响 由图3可得知，当超声时间为20min时，包封率达到最大值，超声时间小于20min时，超声处理对包封率有促进作用，超声时间过长会导致包封率下降，可能是由于长时间超声会引起囊泡破裂，包封率降低。

图3 超声时间对包封率的影响Fig.3 Effect of sonication time on the encapsulation efficiency of niosomes

2.2 响应面分析法优化包埋辣椒红色素的条件

在单因素实验的基础上，根据Box－Behnken中心组合实验设计原理，用三因素三水平响应面分析法优化测定条件。随机设计进行了17组实验，其中中心点实验5个，用以估计实验误差。以A囊泡HLB值、B辣椒红色素添加量、C超声时间为自变量，以类脂囊泡包封率为响应值，实验方案及实验结果见表3。

表3 响应面实验结果Table 3 Results of response surface experiment

利用Design Expert 7.1软件，对实验方案中类脂囊泡包封率测定结果的响应值及3个主要影响因素（表1），进行多元回归分析和最小二乘法拟合，得到响应值对编码变量的二次多项回归模型方程：

Y=79.2+1.28A+2.86B+2.34C－1.63AB－4.53AC+ 13.05BC－16.78A2－7.7B2－11.4C2

对公式进行回归方差分析和显著性检验，回归分析结果见表4。

表4 回归分析结果表Table 4 Regression analysis table

从表3的分析结果来看，该回归模型的R2=0.925， F=54.7，表明92.5%的实验数据可用该模型进行解释，说明模型与实际实验拟合好。整体模型的p值小于0.001，所以该方程是高度显著的。而失拟项的F值为0.77，大于0.05，说明与净误差相关的失拟项不显著，说明该模型拟和结果较好，从另一种意义上讲，这种实验方法是可靠的，从而表明该方程对实验拟合情况好，实验误差小，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。各因素对响应值影响的显著性由F检验来判定。由表3可以看出，3个因素对响应值影响大小次序为：B＞C＞A，即辣椒红色素添加量＞超声时间＞囊泡HLB值。这表明，辣椒红色素的加入量是影响类脂囊泡包封率的最显著因素，其次为超声时间，囊泡的HLB值对包封率影响不显著。

2.3 测定条件的响应面分析

为了分析任意两因素的交互作用，固定第三个因素为零水平，考察其余两个因素的交互作用，即得到响应面，如图4～图6所示。响应面缓说明交互作用不显著，响应面陡说明交互作用显著。由图4～图6可得，图4响应面较图5和图6平缓，说明AB交互作用不显著，AC与BC交互作用显著。由表3可知，交互项AC、BC，所有二次项也均达到极显著水平，其他因素间的交互作用项不显著。回归分析与响应面趋势分析得出的结论相一致。另外从系数项的p值看，一次项B、C达到显著水平。表明各实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

图4～图6直观的给出了个因素交互作用的响应曲面图。从图中可以得出响应面存在最高点，即存在极值。特征值均为负值，说明有极大值存在，即为最大包封率。

图4 HLB值和辣椒红色素添加量对包封率影响的响应面图Fig.4 Responsive surface of HLB and paprika red content on the encapsulation efficiency

图5 辣椒红色素添加量和超声时间对包封率影响的响应面图Fig.5 Responsive surface of sonication time and paprika red content on the encapsulation efficiency

图6 HLB值和超声时间对包封率影响的响应面图Fig.6 Responsive surface of sonication time and HLB on the encapsulation efficiency

2.4 最佳条件的预测与检验

通过回归模型的预测，得到制备类脂囊体的最佳条件为：囊泡HLB值为8.2，超声时间24min，辣椒红色素加入量为0.05g，预测响应值为80.47%。为检验可靠性，采用上述最优条件进行验证实验，得到的响应值分别是为80.2%、82.3%、84.6%，平均值为82.4%，与理论值的误差为2.3%。

3 结论

由响应面实验结果可知，在辣椒红色素添加量、超声时间和囊泡HLB值三个影响包封率的因素中，辣椒红色素添加量和超声时间影响显著。实际操作得出包封率较高的工艺条件为：辣椒红色素添加量0.05g、胆固醇0.2g、HLB=8.2的复配表面活性剂0.4g（司盘80=0.27g，吐温20=0.13g）、超声时间24min。在此条件下类脂囊泡包封率为82.4%，误差2.3%，重复性较好。实验结果证明，通过本文的方法制备辣椒红色素的类脂囊泡是可行的，该法包封率高、重复性较好、比脂质体成本低，具有潜在的应用价值。实验将进一步研究辣椒红色素类脂囊泡对光照和热的稳定性。

[1]李艳梅，王水泉，李春生.辣椒红色素的性质及其应用[J].农产品加工，2009（2）：52－54.

[2]陈丹，吴赞敏，张昊.天然染料辣椒色素的结构、性质和应用[J].染整技术，2010，32（4）：39－41.

[3]Schweiggert U，Kurz C，Schieber A.Effects of processing and storage on the stability of free and esterified carotenoids of red peppers and hot chilli peppers[J].Eur Food Res Technol，2007，225：261－270.

[4]Perez－Galvez A，Hornero－Mrndez D，Minguez－Mosquera MI.Stability of paprika without supplementary antioxidants during storage under industrial controlled conditions[J].J Agric Food Chem，2009，57（11）：4718－4723.

[5]陶莎，杨建华，薛文通，等.辣椒红色素的研究进展[J].食品工业科技，2008，29（8）：307－309.

[6]金青哲，齐策，王兴国，等.辣椒红色素的分离及光稳定性研究[J].食品与生物技术学报，2007，26（2）：54－57.

[7]应国清，熊文说，石陆娥，等.微胶囊的制备及其在食品工业中的进展[J].药物生物技术，2007，14（6）：455－459.

[8]胡长刚，刘杰，李干佐，等.盐或尿素引发阴离子/阳离子表面活性剂复配体系中囊泡自发形成[J].西南师范大学学报：自然科学版，2010（6）：48－53.

[9]赵晓宇，李慧，张保献.新型药物载体非离子囊泡的制备和评价研究进展[J].国际药学研究杂志，2007（6）：439－443.

[10]赵晓宇，李慧，张保献.新型药物载体非离子表面活性剂囊泡的应用研究进展[J].中国医院药学杂志，2008（10）：833－835.

[11]Blazek－Welsh AI，Rhodes DG.SEM imaging predicts quality of niosomes from maltodextrin－based proniosomes[J].Pharm Res，2001，18：656－661.

[12]Xiao Y，Song Y，Chen Z，Ping Q.Preparation of silymarin proliposome：anew way toincreaseoralbioavailability of silymarin in beagle dogs[J].Int J Pharm，2006，319：162－168.

[13]姜树红，戈延茹，汪珠燕.非离子表面活性剂囊泡的研究进展[J].中国现代药物应用，2007（11）：98－101.

[14]杜美菊，李纪钦.类脂囊泡包封维生素C的研究[J].信阳师范学院学报：自然科学版，2007（7）：335－337.

[15]袁悦，王红霞，刘岩，等.类脂囊泡作为5－氟尿嘧啶药物载体的研究[J].分子科学学报，2010（6）：420－423.

Study on optimization of encapsulation of paprika red in niosomes by response surface methodology

LI Xian1，2，WU Yan-wen3，OUYANG Jie1，2，*
（1.Department of Food Science and Engineering，College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；
2.Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；
3.Beijing Center for Physical and Chemical Analysis，Beijing 100089，China）

Factors affecting the encapsulation efficiency in preparing noiosomes were investigated in the presented study，and the optimal condition was obtained by response surface analysis.Results showed that the content of paprika red，ultrasonic time and the HLB of surfactant were the major factors，and the effects of paprika red content and ultrasonic time were significant.Optimal conditions were that the content of paprika red was 0.05g，cholesterol was 0.2g，mixed surfactant which HLB value was 8.2，weight was 0.4g（span 80 was 0.27g，tween 20 was 0.13g）and the sonication time was 24min.Under above conditions，noisome encapsulation rate reached 82.4%，standard error was 2.3%，and good reproducibility was observed.

niosome；paprika red；response surface analysis

TS202.3

A

1002－0306（2013）22－0271－05

2013－03－27 *通讯联系人

李贤（1987－），女，硕士研究生，研究方向：食品添加剂与食品生物技术。

北京市科委科技创新基地培育与发展工程项目（Z121106002812037）；第44批留学回国人员科研启动基金资助项目。