常用防腐剂对黄灯笼辣椒酱腐败菌抑菌作用的优化

李玲玲，仇厚援，陈文学，麦力文

（海南大学食品学院，海南海口570228）

酱腌菜营养丰富，为多种微生物的生长提供了良好环境。酱腌菜在开盖后和长期贮藏过程中都容易发生腐败变质，影响其腐败变质的主要微生物是细菌、酵母菌和霉菌，这些微生物的大量生长繁殖造成了酱腌菜的霉变、腐败[1-2]。Meldrum等发现相对于其他酱类调味品，辣椒酱更容易受到微生物的污染[3]。微生物污染是造成食品腐败或是食源性疾病的一个重要因素[4]，因为微生物的大量繁殖[5]和部分霉菌代谢产物的积累[6]严重影响了食品的保藏期和安全性。因此需要添加适量的防腐剂来抑制微生物的生长繁殖，从而达到延长食品货架期的效果。相对于天然防腐剂与生物防腐剂来讲，化学合成防腐剂具有价格低廉、种类繁多、作用明显等优点[7-8]。目前我国允许在酱腌菜中添加使用的防腐剂主要有苯甲酸钠[9]、山梨酸钾[10]、脱氢醋酸钠[11]、尼泊金复合酯钠[12]等几种。这些防腐剂对每种菌的防腐效果都不相同，因此将几种防腐剂合理的复配使用，通常比单独使用效果更佳[13-14]。张显久[15]和杨楠[16]也都曾做过防腐剂复配添加的实验，对于延长保藏期的效果均比较明显。

因此需开发一种高效、安全的复配型防腐剂来应对黄灯笼辣椒酱易腐败变质的问题。本实验所采用的供试菌为从黄灯笼辣椒酱中分离纯化出的20种腐败菌，分别测定4种常用防腐剂对此20种菌的最低抑菌浓度（MIC）和实验菌的抑菌直径，通过正交实验优化出黄灯笼辣椒酱防腐剂复配配方。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本实验所用菌株 均是从不含防腐剂的腐败变质的黄灯笼辣椒酱中分离纯化所得，共20种，其中细菌11种（A1-A11，A11在初分离时的数量最多）、酵母菌1种（B1）、霉菌8种（C1-C8，C8在初分离时数量最多，但同梯度浓度下的数量小于A11）；苯甲酸钠（安息香酸钠） 食品级，天津东大化工有限公司；山梨酸钾 食品级，王龙集体有限公司；脱氢醋酸钠（脱氢乙酸钠） 食品级，广州市安心生物制品有限公司；尼泊金复合酯钠（对羟基苯甲酸复合酯钠） 食品级，无锡江大百泰科技有限公司；孟加拉红培养基（虎红培养基） 购买于广东环凯微生物科技有限公司。

PL3002型分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BCD-232YMB型容声冰箱 海信容声（广东）冰箱有限公司；DHG-9075A型电热鼓风干燥箱 上海-恒科仪器有限公司；HWS-430型恒温恒湿培养箱 宁波江南仪器厂；MPL-HWS型恒温水浴锅 金坛市大地自动化仪器厂；GI540W型立式自动压力蒸汽灭菌锅 致微仪器有限公司；SW-CJ-IFD型超净工作台 苏州佳宝净化工程设备有限公司。

1.2 培养基的制备

营养琼脂培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂18g，加蒸馏水1000mL，调制pH7.3±1，121℃灭菌20min；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）的配制参照沈萍[17]的方法；各菌所用培养基培养条件见表1。

表1 微生物的选择性培养基及培养条件Table 1 Culture media and culture conditions of different microorganisms

1.3 实验方法

1.3.1 防腐剂母液的配制及其倍比稀释 根据《食品添加剂使用卫生标准》GB 2760-2011[18]中的规定，在腌渍蔬菜中，防腐剂单独使用时最大使用量为：苯甲酸及其盐类≤1g/kg，山梨酸钾及其钾盐≤0.5g/kg，脱氢醋酸钠≤0.3g/kg，尼泊金酯及其钠盐≤0.25g/kg。称取定量的防腐剂粉末，溶解于无菌水中，按二倍稀释法配制实验防腐剂的6个浓度，防腐剂的浓度梯度见表2。

1.3.2 菌悬液的制备 参照国家标准GB 4789.2-2010[19]中菌落总数的测定方并稍作修改，将细菌、酵母菌、霉菌分别接种于各自的选择培养基上按相应条件培养，待培养完成后，用接种环挑取单菌落于100mL无菌水中，振荡10min，再取100μL该菌液涂布于各培养基平板上，分别培养24、48、72h后计数，按国家标准GB 4789.2-2010[19]中计算公式计算出所配菌悬液的活菌浓度，所得菌悬液浓度用无菌水调配至105CFU/mL，于4℃冰箱中保存。

表2 防腐剂的浓度梯度Table 2 The concentration gradient of preservatives

1.3.3 测定方法

1.3.3.1 MIC的测定 参照沈萍等[17]的方法并稍作修改。即在无菌条件下，将各防腐剂按表2所示的浓度分别添加于各培养基平板中，待培养基凝固后加入浓度为105CFU/mL的菌悬液，均匀涂布后恒温培养并观察。以不添加防腐剂只添加菌悬液为空白对照，以培养基平板上完全无菌生长时的防腐剂浓度为MIC。

1.3.3.2 抑菌圈直径的测定 采用6mm滤纸片法[17]，将灭菌后的滤纸片在相应的防腐剂溶液中浸泡30min后取出，贴于已均匀涂布实验菌的培养基平板上，每皿等距离贴三个平行的防腐剂滤纸片和一个空白对照，测定经培养后的抑菌圈直径（抑菌直径=防腐剂抑菌直径－空白对照抑菌直径）。

1.3.4 防腐剂复配添加量的确定 结合各腐败菌的MIC及从腐败变质的黄灯笼辣椒酱中分离时的菌落个数，选取生长繁殖能力较强、对防腐剂较为迟钝、含量较多的腐败菌作为复配防腐剂的实验菌种。

从MIC结果中选择4种防腐剂的合适的浓度范围设计正交实验，其中复配防腐剂的添加比例符合《食品添加剂使用卫生标准》GB 2760-2007附录A.2的规定[18]。以4种防腐剂为因素，以实验菌的抑菌直径为考察指标，建立L16（45）正交实验，确定黄灯笼辣椒酱防腐剂的复配配方，正交实验因素水平见表3。

表3 正交实验因素水平表（mg/mL）Table 3The factors and levels of orthogonal experiment（mg/mL）

2 结果与分析

2.1 MIC测定结果

四种常用防腐剂对黄灯笼辣椒酱腐败菌的抑菌效果和其差异显著性的结果如表4所示。

由表4可知，苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢醋酸钠、尼泊金复合酯钠对供试腐败菌的抑菌效果不同。对于4种防腐剂的MIC分别分析其差异显著性可知，苯甲酸钠对A10、C5和C6三种菌的抑制作用最强，其MIC均为0.125mg/mL；山梨酸钾对C4和C6两种菌的抑制作用最强，其MIC均为0.0625mg/mL；脱氢醋酸钠对A1、A3、A5、A6、A7、A8、A9、A10、C6九种菌的抑制作用较强，其MIC均为0.075mg/mL；尼泊金复合酯钠对A6、A7、B1、C1、C4、C6六种菌的抑制作用较强，其MIC均为0.0625mg/mL。

表4 不同防腐剂对腐败菌的MIC（mg/mL）Table 4 MIC’s of different preservatives against three typical spoilage bacteria（mg/mL）

综合分析四种防腐剂MIC的差异显著性可知，四种防腐剂对A11和C8的MIC最大，其MIC分别为0.05、0.05、0.3、0.25mg/mL，故A11、C8两种菌对四种防腐剂的抗性最强。因此，选定A11、C8这两种菌为防腐剂复配实验菌。

2.2 正交实验结果

以A11和C8两种菌为实验菌进行防腐剂复配实验，以抑菌直径为评价指标，得出正交实验结果见表5，方差分析见表6。

表5 正交实验结果Table 5 The results of orthogonal experiment

由表5和表6正交实验设计和极、方差分析结果可知：四个因素对细菌11号（A11）抑制效果的主次顺序为C＞A＞B＞D，且四种防腐剂对结果影响不显著，极差分析得到最佳水平组合为A1B1C2D1，即添加复合防腐剂中苯甲酸钠浓度为0.24mg/mL，山梨酸钾浓度为0.12mg/mL，脱氢醋酸钠浓度为0.048mg/mL，尼泊金复合酯钠浓度为0.06mg/mL时对细菌11号的抑制效果最好；四个因素对霉菌8号（C8）抑制效果的主次顺序为A＞D＞C＞B，且仅苯甲酸钠对结果影响显著，极差分析得到最佳水平组合为A1B2C3D2，即添加复合防腐剂中苯甲酸钠浓度为0.24mg/mL，山梨酸钾浓度为0.08mg/mL，脱氢醋酸钠浓度为0.024mg/mL，尼泊金复合酯钠浓度为0.04mg/mL时对霉菌8号的抑制效果最好。

表6 正交实验方差分析表Table 6 The variance analysis of orthogonal design（random model）

实验菌A11对应的防腐剂复配组合为A1B1C2D1，实验菌C8对应的防腐剂复配组合为A1B2C3D2，为使两种菌都能较好的被防腐剂抑制，应选择较高浓度的防腐剂复配组合作为最终防腐剂复配组合，故选定A11所对应的防腐剂复配组合A1B1C2D1为实验最佳配方，即添加复合防腐剂中苯甲酸钠浓度为0.24mg/mL，山梨酸钾浓度为0.12mg/mL，脱氢醋酸钠浓度为0.048mg/mL，尼泊金复合酯钠浓度为0.06mg/mL。经验证实验，其对A11的抑菌圈直径为6.83mm，为最佳优化方案。

3 结论与讨论

从本实验可知，苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢醋酸钠和尼泊金复合酯钠4种化学合成类防腐剂对细菌、酵母菌和霉菌的抑制作用明显，本实验最终筛选出的两种菌分别为细菌和霉菌，与这一情况相似的是张显久等[15]的研究，他对从开盖后的辣椒酱中分离出的三株细菌、三株霉菌进行了有效的抑菌实验，即添加了0.05%防腐剂的辣椒酱在开盖后室温下放置了25d才开始发霉。另外杨楠等[16]对三种防腐剂的复配实验也达到了延长食品保质期的效果，因此本研究所得的防腐剂复配配方用于黄灯笼辣椒酱中时应该也能延长食品的保质期。

四种防腐剂对20种供试腐败菌均有抑制作用，但是其抑菌效果不同。通过对其MIC结果的差异显著性分析，可知A11和C8两种菌对实验所用四种防腐剂的抗性较强。通过正交优化得出黄灯笼辣椒酱复配防腐剂的配方为：苯甲酸钠浓度为0.24mg/mL，山梨酸钾浓度为0.12mg/mL，脱氢醋酸钠浓度为0.048mg/mL，尼泊金复合酯钠浓度为0.06mg/mL，此最佳配方下测得A11的抑菌圈直径为6.83mm。

[1]曹宝忠.影响酱腌菜质量的因素及防腐剂应注意的问题探讨[J].中国酿造，2011（3）：145-149.

[2]陈满全.酱腌菜防腐措施的研究[J].食品开发与研究，2004，25（3）：141-144.

[3]Meldrum R J，Little C L，Sagoo S，et al.Assessment of the microbiological safety of salad vegetables andsaucesfrom kebab take-away restaurants in the United Kingdom[J].Food Microbiology，2009，26（6）：573-577.

[4]Havelaar A H，Brul S，De Jong A，et al.Future challenges to microbialfood safety[J].InternationalJournalofFood Microbiology，2010，139：S79-S94.

[5]Tsegaye M，Ephraim E，Ashenafi M.Behaviour of Escherichia coli O157∶H7 during the fermentation of Datta and Awaze，traditional Ethiopian fermented condiments，and during product storage atambientand refrigeration temperatures[J].Food Microbiology，2004，21（6）：743-751.

[6]Iqbal S Z，Asi M R，Zuber M，et al.Natural occurrence of aflatoxins and ochratoxin A in commercial chilli and chilli sauce samples[J].Food Control，2013，30（2）：621-625.

[7]Tajkarimi M M，Ibrahim S A，Cliver D O.Antimicrobial herb and spice compounds in food[J].Food Control，2010，21（9）：1199-1218.

[8]吴坤，孙秀发.营养与食品卫生学[M].北京：人民卫生出版社，2005（5）：284-286.

[9]吕娜.食品防腐剂苯甲酸钠的毒理学研究[D].长春：吉林农业大学，2006.

[10]罗傲霜.食品防腐剂的研制[J].中国食品添加剂，2005（4）：55.

[11]彭家泽.脱氢醋酸钠及其复配形式在食品中的防腐应用研究[J].中国食品添加剂，2007（9）：253-257.

[12]尼泊金酯类在食品工业中的应用[J].中国食品添加剂，2003（1）：118-121.

[13]谢田，赖萍.脱氢醋酸钠对糟辣椒发酵及保藏品质的影响[J].贵州农业科学，2008（2）：151-154.

[14]孙磊.腌制蔬菜复合防腐剂的开发与应用研究[D].合肥：合肥工业大学，2010.

[15]张显久，苏德俏，陈琳，等.辣椒酱防腐剂的研制[J].中国调味品，2007（9）：56-57.

[16]杨楠，陈洪仪.三种食品防腐剂的抑菌效果研究[J].食品工业科技，2007，28（1）：189-192.

[17]沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，1999：90-95.

[18]GB/2760-2011.食品添加剂使用卫生标准[S].中华人民共和国卫生部，2011-04-20.

[19]GB/4789.2-2010.食品微生物学检验-菌落总数测定[S].中华人民共和国卫生部，2010-06-01.