布洛芬抑制博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠一氧化氮生成的机制研究

王春雷，张烨，蔡开霞，王斯琪

（中国医科大学附属第一医院老年病科，沈阳 110001）

氧化应激反应在肺纤维化的发病中起重要作用，其中核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）作为重要的细胞因子、黏附分子及炎性介质的转录因子，参与急性肺损伤的发病［1］。研究表明，肺纤维化中可见 NF-κB 的激活［2，3］。NF-κB 在内、外源性刺激，如射线、化疗药物、活性氧等的参与下，作用于肺巨噬细胞、支气管肺泡上皮细胞等细胞后诱导性一氧化氮合成酶 （inducible nitric oxide synthase，iNOS）mRNA的表达，催化L-精氨酸产生过量一氧化氮（nitric oxide，NO）。iNOS和NO对肺纤维化的发生和发展起重要作用［4，5］。我们的前期研究证实：博莱霉素引起的肺纤维化中，NO表达明显增加，而布洛芬可抑制NO的表达，但其机制并不清楚。本研究拟探讨博莱霉素是否可引起小鼠肺组织中iNOS和NF-κB上调及布洛芬对其产生的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级雄性C57BL/6小鼠购自中国医科大学实验动物中心；博莱霉素购自哈尔滨博莱制药有限公司；布洛芬购自烟台第二制药厂；NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所；NF-κB p50和p65多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；抗iNOS抗体购自美国R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及分组：取健康雄性C57BL/6小鼠 50只，随机分为对照组（A）、模型组（B）、布洛芬 5 mg/kg（C）、10 mg/kg（D）、20 mg/kg（E）治疗组，每组10只。10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉小鼠后，用1 mL注射器吸取博莱霉素溶液（生理盐水配制3 mg/kg）气管快速注射后，将小鼠垂直放置，旋转3周，使博莱霉素均匀分布于肺部，缝合伤口，让小鼠自然清醒。A组注射同容积的生理盐水。C、D、E组注射博莱霉素1 d后，每天分别腹腔注射相应剂量的布洛芬（生理盐水配制）进行治疗，连续28 d。

1.2.2 血清NO含量检测：实验结束后，处死小鼠（每组各5只），腹主动脉采血，4 000 r/min离心10 min，收集血清，用NO化学法试剂盒检测小鼠血清中NO含量。

1.2.3 肺组织NF-κB的检测：实验结束后，处死小鼠（每组各5只）。取支气管、部分肺组织冻存于-80℃备用。采用2步法免疫组织化学法检测：用3%H2O2孵育肺组织超薄切片10 min。加一抗（1︰50兔抗NF-κB p65亚单位的抗体和1︰50兔抗NF-κB p50亚单位的抗体），室温孵育2 h，PBS冲洗，滴加试剂1，室温孵育20 min；PBS液冲洗，滴加二抗，室温孵育20 min。以细胞核染成棕褐色者为阳性细胞。每张病理切片随机选取10个高倍视野，计数其中阳性细胞数，计算阳性细胞占细胞总数的百分比。

1.2.4 Western blot法检测各组肺组织中iNOS蛋白表达水平：取各组小鼠肺组织，RIPA裂解液裂解组织，BCA法进行蛋白质浓度测定，取20 μg等量蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（12%SDS-PAGE），转至PVDF膜，用5%蛋白液洗膜3次。用脱脂奶粉封闭1 h，分别加入兔抗鼠单克隆抗体anti-iNOS（1︰800）和 β-actin（1︰1 500），4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1︰2 000）。ECL显色，凝胶成像分析系统进行扫描。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组小鼠血清NO含量的比较

与对照组［（1.646±0.44）μmol/g］比较，模型组小鼠血清 NO 含量［（5.500±0.87）μmol/g］显著增加（P<0.01）。布洛芬5 mg/kg治疗组血清NO含量［（4.064±0.64）μmol/g］无明显变化，而布洛芬 10 mg/kg治疗组［（2.174±0.51）μmol/g］、20 mg/kg治疗组［（1.927±0.35）μmol/g］血清 NO 含量明显降低（P<0.05，P<0.01），提示布洛芬可缓解肺纤维化所引起的NO增高。而且布洛芬20 mg/kg治疗组的血清NO明显低于5 mg/kg和10 mg/kg治疗组，说明血清NO含量与布洛芬剂量有一定关系。相关分析显示NO下降水平与布洛芬剂量呈负相关（y=-1.260 9x＋6.568 5，R2=0.932 7），具有统计学意义。

2.2 各组肺组织NF-κB含量的比较

如表1所示：与对照组比较，模型组肺组织NF-κB含量显著增加（P<0.01）。布洛芬5 mg/kg治疗组肺组织NF-κB含量无明显变化，而布洛芬10 mg/kg和20 mg/kg治疗组肺组织NF-κB含量明显降低（P<0.05，P<0.01），而且布洛芬20 mg/kg和10 mg/kg治疗组的NF-κB明显低于布洛芬5 mg/kg治疗组。说明布洛芬抑制肺纤维化引起的NO增高与下调NF-κB 有关。

表1 各组肺组织NF-κB的比较（%）Tab.1 Comparison of NF-κB expression in the lung tissues from different groups（%）

2.3 肺组织中iNOS蛋白表达水平

Western blot结果（图1）显示：与正常对照组比较，模型组肺组织iNOS表达明显增加（P<0.01），布洛芬5mg/kg治疗组无明显变化，而布洛芬10mg/kg、20 mg/kg治疗组则明显降低（P<0.05，P<0.01），且布洛芬20 mg/kg、10 mg/kg治疗组iNOS明显低于布洛芬5 mg/kg治疗组。

3 讨论

NO作为一种生物信使分子和细胞毒性效应分子，参与细胞内信号传导，具有舒张动脉、降低血小板黏滞性和抗炎作用，但过量NO及其代谢产物则可导致机体损伤。研究表明，肺内NO的大量生成可能是促使肺纤维化形成的因素之一［4］，但其机制尚不清楚。本研究结果表明：博莱霉素诱导肺纤维化NF-κB表达上调，上调的NF-κB可能通过促进iNOS的转录和翻译增加其蛋白的表达，从而促进NO的生成，而布洛芬则可明显抑制上述反应，起到抑制纤维化的作用。

博莱霉素引起的鼠肺纤维化是公认的肺纤维化模型。目前认为，NO在肺间质纤维化的发生发展，特别是肺泡炎阶段起重要作用［6，7］。其可能的机制为：（1）肺纤维化时产生的NO可扩张微血管，增加毛细血管后微静脉的渗出，加重炎症和组织水肿；（2）通过影响线粒体呼吸链复合物引起细胞毒作用［8］；（3）可能引起肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞和肺成纤维细胞的增殖和调亡，参与肺纤维化的形成［9，10］。布洛芬可抑制NO的大量产生，抑制肺纤维化的发生和发展。本研究结果发现布洛芬可通过抑制NF-κB的表达从而下调iNOS的表达水平，从而降低NO水平。本研究结果为临床治疗肺纤维化提供了一种新的治疗途径。

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