博莱霉素对突变ataxin—3引起的细胞凋亡的影响

王子见 吴文成

摘 要：脊髓小脑共济失调III型（SCA3）是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，目前尚无有效的治疗药物，只能通过某些药物缓解症状。硫酸博莱霉素也称博莱霉素（Bleomycin），用于治疗肿瘤，其作用机制涉及自噬，氧化应激等途径，而这2个通路在SCA3致病过程起重要作用。该研究采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）探索博莱霉素对突变ataxin-3引起的细胞凋亡的影响。实验结果表明，在药物处理2h后，博莱霉素对SCA3细胞没有毒性作用，也没有抑制细胞凋亡的作用；在药物处理24h后，在1000μM浓度时，博莱霉素对SCA3细胞有显著毒性作用。该研究不仅丰富了旧药新发现，也为神经退行性疾病治疗提供了参考依据。

关键词：硫酸博莱霉素；脊髓小脑共济失调III型；细胞凋亡

中图分类号 R744.7 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）20-0032-3

Effect of Bleomycin Sulfate on the Apoptosis Induced by Ataxin-3

Wang Zijian et al.

（College of Biological and Environmental Engineering，Xian University，Xian 710065，China）

Abstract： Spinocerebellar ataxia type 3 is an autosomal dominant neurodegenerative disorder.There is no effective treatment at present，but it can be relieved by several medications.Bleomycin sulfate，also known as bleomycin，is used to treat tumors partly via autophagy and oxidative stress pathway which play an important role in SCA3. This study assesses the effect of bleomycin on the apoptosis induced by mutant ataxin-3 by MTT assay. The experimental results showed that after 2 hours of drug treatment，bleomycin did not show the did not inhibit the apoptosis.24 hours after the drug treatment，the apoptosis was enhanced by bleomycin at a concentration of 1000μM. This investigation provides new function of old drug and also supplies a proof for neurodegeneration diseases in further studies.

Key words：Bleomycin sulfate；Spinocerebellar ataxia type 3；Apoptosis

遗传性脊髓小脑共济失调（Spinocerebellar ataxias，SCAs）是一类影响人类神经系统的迟发型神经退行性疾病，其具有动态突变的特征，致病机理复杂，由三核苷酸动态突变扩展引起[1]，呈常染色体显性遗传，临床上具有多种表现特征，如共济失调、弓形足、视神经萎缩、脊柱侧弯、心肌病、认知功能受损、眼肌麻痹、失明、痉挛、肌肉萎缩和感觉障碍等症状。除此之外，研究发现大多数SCA的临床表现涉及到多个系统，除了影响小脑和脊髓之外，还影响其他区域如中枢和外周系统[2]。据报道，SCAs包括SCA1-14（无SCA9）13个亚型，其中发病率最高的是脊髓小脑共济失调Ⅲ型（SCA3）[3]，以痉挛性共济失调为突出表现，发病方式呈家族性和发散性，疾病的相关基因是ATXN3，编码的蛋白是ataxin-3[4]，该基因CAG重复扩增，正常人CAG以12～42次为正常重复次数，患者为52～84次，SCA3患者诊断方法有临床诊断和基因诊断2种。目前没有有效的药物对其进行治疗，临床治疗以延缓病情发展和对症治疗为主，以提高患者的生活质量。硫酸博莱霉素是一种广谱的抗肿瘤药物，也用来诱导建立肺纤维化动物模型[5]。肺纤维化和自噬相关，自噬在肺纤维化和纤维增生性肺病的发病过程中可能起到了双重作用，而氧化应激、内质网应激、缺氧等因素也参与了肺纤維化发病过程[6]。在神经退行性疾病中，尤其是SCA3，自噬和氧化应激在突变蛋白核异位，形成的聚集体等发病过程中起到了重要作用[7]。因此，本实验通过ataxin-3突变质粒转染HEK293细胞（人胚肾细胞），构建SCA3细胞模型，采用MTT方法，研究博莱霉素对突变ataxin-3引起的细胞凋亡的影响。此课题揭示博莱霉素旧药新作用，为SCA3/MJD疾病的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 HEK293细胞由伦敦大学学院薛少安教授惠赠。peGFP-ataxin-3-77CAG质粒由德国图宾根大学Thorsten Schimdt博士惠赠。博莱霉素购自Selleck Chemical公司（Cat.No.S1214）。

1.2 方法

1.2.1 质粒转化和提取 取出感受态细胞DH5α（大肠杆菌）于冰上融化，加入质粒，混匀，置于冰上30min；随后42℃热击90s，迅速置冰上，加入不含抗生素的LB培养基混匀，37℃恒温摇床（150r）摇45min。取出菌液，划线涂板，37℃倒置过夜培养；选取菌落进行挑菌，PCR鉴定。将PCR鉴定成功的菌落挑出，加入培养基，37℃摇床（150r）摇菌过夜。次日，取出菌液，离心（2000r，10min），弃去上清液，按照GIAGEN plasmid mini kit试剂盒说明书提取质粒，使用Nanodrop2000检测质粒浓度。

1.2.2 转染与加药 按照梭华sofast转染试剂说明书，取2μg质粒，3μL梭华sofast，100μL培养液，室温静置30min，加入到六孔板内。24h后，转移至96孔板，24h后加药处理，DMSO为阴性对照组，只含细胞为未处理对照组，药物时间分别为2h和24h。

2 结果与分析

2.1 SCA3细胞模型的构建 通过将ataxin-3-77Q质粒转染至HEK293细胞，使其蛋白表达，构建SCA3细胞模型。转染48h后，收集和裂解细胞，提取细胞总蛋白，检测细胞中含扩增PolyQ的突变ataxin-3蛋白。Western blot结果显示，HEK293细胞过表达ataxin-3-77Q蛋白，SCA3细胞模型构建成功（图1）。如图1所示，采用ataxin-3蛋白抗体（1H9抗体）和β-actin蛋白抗体孵育，得到75KD大小的突变ataxin-3蛋白和42KD大小的β-actin蛋白，其中1-2是不同蛋白样本。

2.2 博莱霉素处理SCA3细胞模型2h后的影响 加入不同浓度的溶解在水中的博莱霉素2h后，以阴性对照组水为对照，MTT结果显示，博莱霉素浓度从1000μM到1μM时，细胞活性有上升的的趋势，并且在药物浓度为1μM时所对应的OD值最高，即此浓度对应的细胞凋亡数目最少（图2）。但是通过独立样本T-检验可知，该浓度和阴性对照组相比P=0.7096（P>0.05），无显著性。因此，在药物处理2h后，不同浓度的博莱霉素对SCA3细胞模型没有毒性，对细胞活性也没有显著的影响。

2.3 博莱霉素处理SCA3细胞模型24h后的影响 博莱霉素处理SCA3细胞模型2h后，对细胞活性没有显著影响，因此继续加大作用时间，将药物处理细胞24h后观察结果。以阴性对照组水为对照，MTT结果显示，博莱霉素浓度从1000μM下降到0.01μM时，细胞活性有上升的的趋势，但是，通过独立样本T-检验可知，不同浓度和阴性对照组相比均P>0.05，仍无显著性。但是，当博莱霉素浓度在1000μM，能够显著增加细胞毒性（或增加细胞凋亡）（P<0.05）。因此，不同浓度的博莱霉素处理SCA3细胞模型24h后，对细胞活性没有显著影响，但是浓度在1000μM时，对细胞模型有毒性（图3）。

3 结论与讨论

脊髓小脑共济失调III型（SCA3）是由于ATXN3基因突变导致，会引起CAG重复序列异常增加，其表达出的蛋白质异常，出现错误折叠，进而形成核内包涵体引起细胞凋亡。硫酸博莱霉素，是一种广谱抗肿瘤药，作用机制主要是通过与DNA结合引起核酸链断裂，除此以外，该FDA药物还涉及自噬，氧化应激等途径。重要的是该药物可以通过血脑屏障，对于神经系统疾病意义重大。基于以上理论，本研究探索硫酸博莱霉素是否可能影响SCA3细胞活性。通过MTT实验数据分析得出，以H2O为阴性对照组，加药2h后，博莱霉素药物处理组6个浓度与对照组作样本T-检验时发现，P值均大于0.05，故无显著性，表明不同浓度的药物处理2h后对细胞没有毒性；加药处理24h后，博莱霉素药物处理组6个浓度与对照组作样本T-检验时得出，浓度在1000μM时，可以显著增加细胞毒性。因此，可以推断，硫酸博莱霉素随着加药时间变长，其毒性效果变得更明显，这为下一步进行该药物对ataxin-3核转运和聚集体的形成的影响等研究提供了浓度和作用时间参考依据。此外，在利用GraphPad Prism软件进行统计学分析时，发现error bar個别偏大，特别是加药处理2h的数据，这也可能是由于在加入MTT时，DMSO时并未完全使其混匀，会导致OD值有所变化。在最后弃去上清时，甲臜易被弃去从而导致实验数据误差较大。综上所述，硫酸博莱霉素对突变ataxin-3引起的细胞凋亡没有显著影响，在高浓度时还会产生细胞毒性。因此，下一步还需要探讨该FDA药物对SCA3细胞模型其他的病理变化，比如突变ataxin-3核异位以及形成的“有毒”包涵体的影响。

参考文献

[1]Zijian Wang.Experimental and clinical strategies for treating spinocerebellar ataxia type 3，Neuroscience.2018 Feb 10； 371：138-154.doi：10.1016/j.neuroscience.2017.11.051.

[2]Paulson H.Machado-Joseph disease/spinocerebellar ataxia type 3[J].Handb Clin Neurol，2012，103：437-449.

[3]黄丽华，周华东.脊髓小脑型共济失调的研究进展[J].重庆医学，2008（07）：732-735.

[4]Saute JAM，Jardim LB （2015） Machado Joseph disease： clinical and genetic aspects，and current treatment[J].Expert Opin Orphan Drugs 3：517-535.

[5]金晓光，代华平，庞宝森，等.博来霉素致大鼠肺纤维化模型肺组织的动态病理变化及其发生机制[J].中国病理生理杂志，2009，25（4）：708-714.

[6]王妍妮，王昌明.细胞自噬在肺纤维化中作用的研究进展[J].中国呼吸与危重监护杂志，2016，15（4）：417-420.

[7]花芳，余娇娇，李珂，等.自噬影响衰老及老年病的研究进展[J].药学学报2014，49（6）：764-773.

（责编：张宏民）