白细胞介素13抗体对支气管哮喘小鼠气道炎症的影响

温建立，刘胜华

（贵州省遵义医学院第三附属医院重症监护室，贵州 遵义 563002）

白细胞介素 13（interleukin-13，IL-13）是由活化的Th2细胞产生的调节过敏性炎症的重要细胞因子［1，2］。IL-13通过结合二聚体受体激活下游信号通路，在支气管哮喘（以下简称哮喘）发病中起重要作用。它可诱发气道高反应性（airway high reactivity，AHR）IgE增高及黏液分泌增多等变态反应，同时与杯状细胞增生和上皮细胞下纤维性化相关。研究表明，抑制IL-13可有效缓解哮喘症状。本研究拟采用B细胞表位技术制备抗IL-13抗体，探讨抗IL-13抗体在哮喘治疗中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

新西兰大耳白兔和雄性BALB/C小鼠购自军事医学科学院动物中心；匙孔戚血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、鸡卵蛋白（ovalbumin，OVA）、弗氏完全佐剂及弗式不完全佐剂购自Sigma公司；HRP标记羊抗兔IgG和ECL显色试剂盒购自中杉金桥公司；细胞因子检测试剂盒购自深圳晶美公司；其他试剂为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 抗原表位分析：利用Ensembl数据库和抗体设计软件（Dragonfly）分析IL-13蛋白的二级结构、疏水性、亲水性、抗原性及表面可及性等特点，选择IL-13特异的片段作为拟合成的多肽，用于制备针对全蛋白的多克隆抗体。

1.2.2 免疫原及抗体纯化凝胶制备：IL-13多肽片段由北京三博生物科技有限公司合成（纯度＞98%），在合成多肽的C末端加一半胱氨酸用于与KLH的耦联。将IL-13多肽片段溶于PBS缓冲液中，加入已溶解的KLH蛋白，0.3%的戊二醛耦联2 h，甘氨酸溶液终止反应［3］。IL-13片段与活化凝胶耦联：连接缓冲液（50 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA）溶解合成的 IL-13多肽，加入凝胶混合30 min，以封闭液封闭30 min完成抗体纯化凝胶制备。

1.2.3 IL-13多克隆抗体制备：通过皮下多点注射方式免疫新西兰大耳白兔，多肽-KLH耦联物免疫剂量为100 μg/次。每2周免疫1次，共免疫4次。其中，首次免疫与弗氏完全佐剂乳化混匀，第2～4次免疫与弗式不完全佐剂乳化混匀。耳缘静脉采血测定抗体效价，符合要求时，颈动脉取血，分离抗血清，保存于-20℃。

1.2.4 IL-13多克隆抗体纯化：采用亲和层析法。抗血清经过硫酸铵沉淀，PBS透析后与肽连接凝胶4℃混合过夜，装柱。以甘氨酸溶液洗脱2～3次，合并收集的洗脱液，经过PBS透析后，BCA法测定蛋白浓度。纯化的抗体分装保存于-20℃。

1.2.5 抗体效价及特异性检测：通过间接ELISA方法测定抗体效价。多肽-KLH耦联物最终包被浓度为 0.5 μg/mL，包被量 100 μL/孔；5%脱脂奶粉 37 ℃封闭2 h，OBST洗涤3次，每次3～5 min；加入倍比稀释的抗体孵育1 h，PBST洗涤；二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG，37℃反应30 min；PBST充分洗涤后显色5～10 min，2 mol/L硫酸终止反应。在450 nm波长处测OD值。以S/N>2.1为阳性值。

1.2.6 动物哮喘模型建立及分组：取6～8周龄雄性BALB/c小鼠，每只小鼠于第1天和第8天腹腔注射30 μg OVA（溶于 100 μL PBS）和等体积氢氧化铝，以后每隔1周雾化吸入5%OVA，20 min/次，共4次。根据哮喘激发前尾静脉注射抗体不同将小鼠分为：（1）兔IgG组：雾化吸入前1 h静脉注射兔IgG（20 μg/只）；（2）IL-13抗体组：雾化吸入前 1 h静脉注射兔 IL-13 多克隆抗体（20 μg/只）；（3）PBS 组：雾化吸入前1 h静脉注射等量PBS缓冲液。阴性对照组用生理盐水代替OVA进行腹腔注射。

1.2.7 支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）细胞计数及细胞因子水平检测：给予小鼠气管插管，用预冷的PBS缓冲液灌洗肺组织2次，每次1 mL，收集合并灌洗液，4℃1 000 r/min离心5 min，分离上清和细胞沉淀。用0.8 mL Hank液重悬细胞沉淀，测定细胞总数。涂片，Wright-Giemsa染色，细胞分类计数。眼眶采血，离心分离血清，EILSA法测定小鼠血清中细胞因子水平，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.8 肺组织切片检查：取小鼠肺组织，10%甲醛缓冲液浸泡48 h，制成石蜡包埋切片，嗜依红和苏木精染色后观察肺组织病理变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 多肽序列选择

通过软件对IL-13蛋白的二级结构、柔韧性、亲水性、抗原性和表面可及性进行综合分析，IL-13蛋白第12～26氨基酸序列LTKELIEELSNITQ可作为IL-13的抗原表位。

2.2 多肽抗体效价、纯度及特异性检测结果

将合成多肽与KLH耦联并免疫新西兰大耳白兔，ELISA法免疫3次检测血清抗体效价达到1︰104。免疫周期结束后，采用亲和层析方法纯化抗体，抗体浓度达到3.25 g/mL；纯化后抗体效价达到1︰105。

2.3 细胞计数和细胞因子检测

细胞计数结果如表1所示：经OVA诱导哮喘后，IL-13组、兔IgG组和PBS组小鼠的BALF中细胞数量显著高于阴性对照组小鼠（P<0.01）；IL-13抗体组的BALF中细胞数量少于PBS组和兔IgG组，差异有统计学意义（P<0.01），而兔IgG组和PBS组小鼠BALF中细胞总数差异无统计学意义（P>0.05）。提示IL-13参与哮喘发生，IL-13中和抗体可抑制哮喘病程发展。

表1 小鼠BALF中细胞计数及分类（n=8）Tab.1 Categorization and count of leucocytes in BALF of mice（n=8）

通过ELISA法测定BALF中细胞因子，结果如表2所示：与阴性对照组相比，PBS组和兔IgG组细胞因子 IL-4、IL-5显著升高（P<0.01），而 γ-IFN 显著降低（P<0.01）；IL-13抗体组BALF中IL-4、IL-5显著低于PBS组和兔IgG组（P<0.05），γ-IFN明显高于PBS组和兔IgG组（P<0.05），进一步证实了IL-13抗体的中和作用。

表2 小鼠BALF中细胞因子含量（pg/mL，n=8）Tab.2 Cytokine levels of BALF in mice（pg/mL，n=8）

2.4 肺组织病理检查结果

病理检查结果如图1所示：OVA诱导哮喘组（IL-13组、兔IgG组、PBS组）与阴性对照组比较，支气管和血管炎症及肺气肿程度明显。IL-13抗体组小鼠支气管和肺泡炎症较兔抗IgG组和PBS组明显减轻。

3 讨论

支气管哮喘是由肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞等多种细胞参与的慢性呼吸系统疾病，主要表现为气道高反应和气道非特异性炎性反应。目前主要应用激素治疗哮喘，但激素治疗有一定的缺陷，如容易产生依赖性和耐药性。同时，激素作用的非特异性也限制了其应用。因此，寻找新的治疗途径成为哮喘研究的热点。

研究认为，Th2细胞因子IL-13与哮喘病情发展密切相关［4］，它能促进趋化因子产生，上皮下纤维化，杯状细胞增生及气道黏液增多，并激活中性粒细胞和肥大细胞，参与气道重建。随着人们对IL-13研究的深入，IL-13在哮喘中的作用日益受到人们的重视，探索抑制IL-13的方法可为治疗哮喘提供新的途径。研究表明，阻断IL-13可缓解哮喘症状。Lively等［5］发现，通过IL-13 RNA干扰可减弱气道炎症和气道高反应，Lee等［6］利用化学修饰干扰RNA也得到类似结果，Bree等［7］通过IL-13抗体阻断IL-13可改善食蟹猴哮喘症状，Ma等［8］利用IL-13肽段制备的疫苗能够减轻气道炎症状。

本研究通过序列分析选择了IL-13特有的抗原表位，与KLH耦联制备抗IL-13抗体。抗体效价达到1︰105，通过亲和层析方法获得的抗体纯度达到80%以上，且该抗体能特异识别IL-13全蛋白，而不与其他蛋白发生反应，说明通过抗原表位制备的抗体具有较高特异性。用制备的抗体治疗小鼠哮喘模型，结果表明该抗体能有效减轻IL-13引起的炎性反应，说明制备的抗体能够中和IL-13，缓解哮喘症状。

［1］Kasaian MT，Tan XY，Jin M，et al.Interleukin-13 neutralization by two distinct receptor blocking mechanisms reduces immunoglobulin E responses and lung inflammation in cynomolgus monkeys［J］.Pharmacol Exp Ther，2008，325（3）：882-892.

［2］Kearley J，Buckland KF，Mathie SA，et al.Resolution of allergic inflammation and airway hyperreactivity is dependent upon disruption of the T1/ST2-IL-33 pathway［J］.Am J Respir Crit Care Med，2009，179（9）：772-781.

［3］朱风尚，黄志刚，胡莺，等.抗PIWIL2蛋白多克隆抗体的制备、鉴定及初步应用［J］.第二军医大学学报，2008，9（29）：1034-1037.

［4］Vogel G.Interleukin 13 is key role in asthma shown ［J］.Science，1998，282（5297）：2168-2169.

［5］Lively TN，Kossen K，Balhorn A，et al.Effect of chemically modified IL-13 short interfering RNA on development of airway hyperresponsiveness in mice［J］.J Allergy Clin Immunol，2008，121（1）：88-94.

［6］Lee CC，Huang HY，Chiang BL.Lentiviral-mediated interleukin-4 and interleukin-13 RNA interference decrease airway inflammation and hyperresponsiveness［J］.Hum Gene Ther，2011，22 （5）：577-586.

［7］Bree A，Schlerman FJ，Wadanoli M，et al.IL-13 blockade reduces lung inflammation after Ascaris suum challenge in cynomolgus monkeys［J］.J Allergy Clin Immunol，2007，119（5）：1251-1257.

［8］Ma Y，HayGlass KT，Becker AB，et al.Novel recombinant interleukin-13 peptide-based vaccine reduces airway allergic inflammatory responses in mice［J］.Am J Respir Crit Care Med，2007，176（5）：439-445.