疏风解毒胶囊经miR-155/JAK1-STAT1信号通路发挥对甲型流感病毒H1N1肺炎模型小鼠的保护作用*

李振华， 张 华△， 陈建丽， 徐 超， 谢林森， 张 艺， 张 倩

（1郑州大学附属郑州中心医院呼吸与危重症医学科，河南 郑州 450007；2郑州大学附属郑州中心医院检验科，河南 郑州 450007）

甲型流感病毒H1N1 肺炎是由单股RNA 病毒引起的急性呼吸道传播疾病，可通过飞沫、气溶胶、接触传染，传染性强，感染后患者重症转归不良的风险较高，部分患者恶化后造成呼吸窘迫或衰竭，危及生命［1］，及时有效的干预对于患者至关重要。以往研究主要以西药治疗为主，奥司他韦作为其中一种西药，由于广泛使用，患者体内往往产生了耐药性，造成效果不佳［2］，而中药药效持久且副作用小，为甲型流感病毒H1N1 肺炎提供了新的治疗方向。疏风解毒胶囊（Shufeng-Jiedu capsule，SFJDC）中有虎杖、连翘等多种中药成分，对病原菌具有广泛抑制作用［3-5］，能够减轻感染导致的局部炎症，增强组织抵抗力和修复能力［6］，但鲜有关于甲型流感病毒H1N1 肺炎的研究。微小RNA（microRNA，miR）-155 参与肺部损伤过程［7］，可通过调控 Janus 激酶（Janus kinase，JAK）-信号转导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路介导炎症反应，影响牙周炎发生［8］。本研究探讨SFJDC对甲型流感病毒H1N1肺炎模型小鼠的影响，并初步探讨其作用机制。

材料和方法

1 动物及病毒株

50 只 SPF 级雄性 BALB/c 小鼠，6～7 周龄，体重（20±2）g，购自北京维通利华实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。在温度（26±1）℃、湿度（55±5）%、12 h 光照12 h 黑暗环境中饲养。本实验经本院伦理委员会审核并通过。甲型流感病毒鼠肺适应株（A/FM/1/47-MA）由中国预防医学科学院病毒研究所提供。

2 主要药品及试剂

SFJDC 由天津药物研究所有限公司提供，每粒0.52 g，由虎杖、连翘、板蓝根、马鞭草、败酱草、柴胡、芦根和甘草组成，各药材均符合2015 年版《中国药典》相关标准。miR-155 siRNA及miR-155和U6引物由上海生工生物有限公司合成；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；小鼠转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，抗 JAK1、p-JAK1、STAT1 和 p-STAT1抗体，羊抗兔Ⅱ抗，BCA蛋白试剂盒（Abcam）；cDNA 第一条链合成试剂盒（上海佰易聚生物有限公司）；2× SYBR qPCR Mix（北京庄盟国际生物有限公司）；DAB 工作液（杭州浩克生物科技有限公司）。QuantStudio 3 实时荧光定量PCR 仪（ABI）；UVP Gel-Solo蛋白凝胶成像仪（Jenapharm）。

3 主要方法

3.1 分组及建模 小鼠按随机数字法分为对照组、模型组、低剂量SFJDC 组、高剂量SFJDC 组和SFJDC+miR-155 siRNA 组，每组10 只。除对照组外，其余各组参考文献［9］将小鼠用乙醚轻度麻醉，以15×LD50流感病毒液鼻滴感染小鼠，每只0.035 mL，对照组鼻滴等体积蒸馏水。从感染当天起，低、高剂量SFJDC 组分别灌胃0.1 和0.5 g/（kg·d）SFJDC［10］，SFJDC+miR-155 siRNA 组灌胃0.5 g/（kg·d）SFJDC并尾静脉注射miR-155 siRNA，对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，每天1次，连续5 d。

3.2 肺指数检测 立即处死小鼠，迅速解剖摘取肺，生理盐水清洗干净，吸干表面水分，称重，参考文献［11］检测各组小鼠肺指数。肺指数=小鼠肺质量（mg）/体质量（g）。

3.3 HE 检测肺组织病理情况 部分肺组织置于4%多聚甲醛中固定，经脱水、二甲苯透明后，石蜡包埋，切片机切片，切片厚度4 μm。切片经染色，依次进入二甲苯和乙醇中脱蜡，苏木精染色、1%盐酸乙醇分化、伊红复染，二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察肺组织情况。

3.4 ELISA 检测肺组织中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平 部分肺组织添加蛋白裂解液，冰上匀浆并充分裂解20 min，11 180×g、4 ℃离心20 min，上清液为总蛋白。参考小鼠TGF-β、IL-6和TNF-α ELISA 试剂盒检测肺组织中TGF-β、IL-6和TNF-α水平。

3.5 实时荧光定量PCR 检测肺组织中miR-155 水平 部分肺组织手术剪在冰上剪碎、添加Trizol冰上研磨，提取总RNA，cDNA 第一条链合成试剂盒合成cDNA，实时荧光定量PCR 检测肺组织中miR-155 水平。miR-155的上游引物序列为5'-CGGCGGTTAATGCTAATTGTGAT-3'，下游引物序列为5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 的上游引物序列为5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，下游引物序列为5'-AAATATGGAACGCTTCACGA-3'。20 μL 反应体系：2 μL cDNA，10 μL 2×SYBR qPCR Mix，上、下游引物（均为 10 μmol/L）各 1 μL，6 μL ddH2O。反应条件：94 ℃ 20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40个循环。2-ΔΔCt法计算miR-155相对表达水平。

3.6 蛋白免疫印迹检测肺组织中JAK1、p-JAK1、STAT1 和p-STAT1 蛋白水平 部分肺组织手术剪剪碎，添加蛋白裂解液冰上研磨并裂解，11 180×g、4 ℃离心20 min，上清为总蛋白，BCA 蛋白试剂盒检测蛋白浓度，20 μg 上样量经凝胶电泳分离蛋白，硝酸纤维素膜280 mA转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，对应加入 JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1 和 GAPDH 抗体，4 ℃孵育过夜；加入对应Ⅱ抗，室温孵育1 h。DAB 工作液避光显色，蛋白凝胶成像仪拍照和灰度分析。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 7 软件进行统计学分析。计量数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较行SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SFJDC对肺指数的影响

与对照组相比，模型组肺指数显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，低、高剂量SFJDC 组肺指数显著降低（P＜0.05）；与SFJDC 低剂量组相比，SFJDC 高剂量组肺指数显著降低（P＜0.05）；与SFJDC 高剂量组相比，SFJDC+miR-155 siRNA 组肺指数显著升高（P＜0.05），见图1。

Figure 1. Comparison of lung index in the 5 groups. Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose SFJDC group；▲P＜0.05 vs high-dose SFJDC group.图1 5组肺指数水平比较

2 SFJDC对肺组织的影响

对照组小鼠肺组织肺泡结构完整、清晰，间质间无充血、坏死、炎症浸润等病理现象；模型组小鼠肺结构消失，肺泡出现明显断裂、融合、渗出，肺间质出现明显炎症浸润、水肿、充血现象；随着SFJDC 剂量的升高，肺泡断裂现象减少，肺泡融合及肺间质炎症浸润现象减轻，组织水肿缓解；在高剂量SFJDC 基础上使用miR-155 siRNA 后，大鼠肺组织病变较SFJDC高剂量组加重，见图2。

Figure 2. Morphological changes of lung tissues of the mice in the 5 groups. The scale bar=50 μm. Control group：the structure was complete without pathological phenomenon；model group：lungs showed destruction of the structure，and the arrow showed generous phenomenon of inflammatory infiltration and congestion；low-dose SFJDC group：alveolus pulmonis appeared，and arrow showed that phenomena of inflammatory infiltration and congestion were reduced；high-dose SFJDC group：the phenomenon of alveolar rupture was basically disappeared，and arrow showed there was almost no phenomenon of inflammatory infiltration and congestion，and the bronchial wall became significantly thinner than that in low-dose SFJDC group；SFJDC+miR-155 siRNA group：arrow showed that inflammatory infiltration and congestion increased compared with highdose SFJDC group.图2 5组小鼠肺组织形态

3 SFJDC 对肺组织中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平的影响

与对照组相比，模型组肺组织中TGF-β、IL-6 和TNF-α 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，低、高剂量SFJDC 组肺组织中TGF-β、IL-6和TNF-α水平显著降低（P＜0.05）；与低剂量SFJDC 组相比，高剂量SFJDC 组肺组织中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平显著降低（P＜0.05）；与高剂量SFJDC 组相比，SFJDC+miR-155 siRNA 组肺组织中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平显著升高（P＜0.05），见图3。

4 SFJDC 对肺组织中 miR-155 及 JAK1、p-JAK1、STAT1和p-STAT1蛋白水平的影响

与对照相比，模型组肺组织中miR-155 水平显著降低（P＜0.05），p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1比值显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，低、高剂量SFJDC 组肺组织中miR-155 水平显著升高（P＜0.05），p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1 比值显著降低（P＜0.05）；与低剂量SFJDC 组相比，高剂量SFJDC组肺组织中 miR-155 水平显著升高（P＜0.05），p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1 比值显著降低（P＜0.05）；与高剂量SFJDC 组相比，SFJDC+miR-155 siRNA 组肺组织中miR-155 水平显著降低（P＜0.05），p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1 比值显著升高（P＜0.05），见图4。

讨 论

甲型流感病毒H1N1 肺炎在2009 年全球爆发，患者表现为发热、咳嗽、恶心、呕吐等流感样症状。中医认为这属于“寒毒疫”，邪毒侵入人体，正邪相争而发热，故发热而口微渴或不渴，饮水少，后期高热耗伤而出现口渴喜饮；吴又可《温病条辨》指出：“世多言寒疫者，究其病状，则憎寒状热，头痛骨节烦疼，虽发热而不甚渴……”［12］。为探索治疗甲型流感病毒H1N1 肺炎的有效药物，本研究利用H1N1 流感病毒建立该疾病的小鼠模型，显示小鼠肺部肺泡出现明显断裂、融合、渗出，肺间质出现明显炎症浸润、充血、水肿，这些病理改变导致肺部重量增加，导致肺指数升高，提示模型中小鼠肺组织出现明显的病理损伤，模型建立成功。

Figure 3. The levels of TGF-β（A），IL-6（B）and TNF-α（C）in lung tissues of the mice in the 5 groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose SFJDC group；▲P＜0.05 vs high-dose SFJDC group.图3 5组肺组织中TGF-β、IL-6和TNF-α水平比较

中医在治疗甲型流感病毒H1N1 肺炎中表现出独特优势，中药SFJDC 以虎杖和连翘为君药，虎杖具有祛风、利湿、破淤、清肝凉血之功效，连翘可清热解毒、散结、凉血清肿；诸药配伍，板蓝根清热解毒、清血利咽，马鞭草活血化瘀，败酱草祛瘀止痛、除痈肿结热，柴胡结表，芦根清降肺胃、生津止渴；甘草为使，调和诸药［13］。本研究检测显示，经 SFJDC 治疗后，模型小鼠肺组织炎症浸润、充血、水肿现象减少，肺指数降低，提示SFJDC 能够减轻肺组织损伤，实现对甲型流感病毒H1N1肺炎小鼠肺损伤的缓解，具体机制尚需进一步研究。

TGF-β、IL-6 和 TNF-α 与甲型 H1N1 流感病毒关系密切，甲型H1N1流感病毒侵入机体后募集多种免疫细胞，免疫细胞中单核巨噬细胞可产生TGF-β、IL-6 和TNF-α，逐步入侵肺部，刺激内皮细胞和白细胞释放一系列炎症因子，引起免疫损伤［14-15］。本研究结果亦显示，模型组肺组织中炎症因子TGF-β、IL-6 和TNF-α均处于高表达状态，SFJDC能够降低以上因子水平，起到抑炎作用。有研究观察到miR-155 作为多功能miRNA，可参与天然免疫、特异性免疫过程，可调控小胶质 BV-2 细胞炎症因子分泌［16］；JAK1-STAT1 通路是众多细胞因子信号转导中的共同途径，参与细胞增殖、分化、凋亡、炎症等多种过程，参与炎症因子的传导与调控［17］，其激活在甲型流感病毒FM1 诱导肺炎发生过程中发挥促进作用［18］。此外，miR-155 可调控下游靶标SOCS1 表达，导致JAK1-STAT1 通路磷酸化激活，进而使巨噬细极化、释放炎症因子，促进动脉粥样硬化进展［19］。以上研究表明，miR-155/JAK1-STAT1 可是在甲型流感病毒FM1 诱导肺炎发生发展机制中发挥重要作用。本研究显示，模型组肺组织中miR-155 低表达，JAK1-STAT1 通路处于激活状态，提示miR-155/JAK1-STAT1 通路参与肺损伤炎症过程，与上述研究一致。另添加SFJDC 后，随着剂量的升高，小鼠肺组织中miR-155 水平逐渐升高，JAK1-STAT1 通路激活程度降低，提示SFJDC 可升高miR-155、抑制JAK1-STAT1通路，这可能是SFJDC 缓解甲型流感病毒H1N1肺炎小鼠体内炎症发应的调控途径。故本研究在高剂量SFJDC 基础上进一步使用miR-155 siRNA 下调miR-155，结果显示JAK1-STAT1通路激活程度升高，炎症因子水平升高，SFJDC 对甲型流感病毒H1N1 肺炎小鼠的肺组织损伤的缓解作用减弱，表明SFJDC 通过升高miR-155，进而抑制JAK1-STAT1通路激活，降低炎症反应，缓解甲型流感病毒H1N1肺炎。

Figure 4. The miR-155 level，and the JAK1，p-JAK1，STAT1 and p-STAT1 protein levels in lung tissues of the mice in the 5 groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose SFJDC group；▲P＜0.05 vs high-dose SFJDC group.图4 5组肺组织中miR-155及JAK1、p-JAK1、STAT1和p-STAT1蛋白水平

综上所述，SFJDC 可缓解甲型流感病毒H1N1 肺炎小鼠炎症损伤，其机制与升高miR-155、抑制JAK1-STAT1通路有关。