溃疡性结肠炎及溃疡性结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型中血管生成因子的表达及其与血管新生的关系

刘维新，张绅，任益，桑立轩，顾寿智

（1.中国医科大学附属第一医院消化内科，沈阳 110001；2.聖隷クリストファー大学，浜松 4338558，日本）

恶性肿瘤是当今导致世界人类死亡的主要原因之一［1］，其中约1/4的患者其病因及发病机制与慢性炎症相关［2，3］。炎性肠病的年发病率约为2.2/10万［4］，而炎性肠病患者发生结直肠癌的风险较非炎性肠病者大大增加，患炎性肠病8～10年后结直肠癌的发病率每年以0.5%～1%递增，30年后高达18%［5］。尽管与炎性肠病相关的结直肠癌仅占全部结直肠癌的1%～2%，但却是造成炎性肠病患者死亡的主要原因［6］。溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎性肠病中常见的一个类型，反复发作的慢性炎症常进展为结直肠恶性肿瘤，而恶性肿瘤的发生和进展与其血管生成密切相关。新近研究表明，血管生成素（angiopoietin，Ang）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体 Flk-1以及直接或间接调控VEGF表达的缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）等均是参与调节恶性肿瘤血管生成的重要因素［7］。葡聚糖硫酸钠（dioctyl sodium sulfosuccinate，DSS）多循环饮用可诱导小鼠发生与人类临床和病理相似的UC［8］，1，2-二甲肼（DMH）/DSS联合法可诱导小鼠发生UC相关性结直肠癌 （ulcerative colitis-associated colorectal cancer，UCACRC），可成功模拟炎性肠病诱发结直肠癌的全过程［9］。本文利用以上2种方法建立UC及UCACRC 小鼠模型，检测 Ang-2、VEGF、Flk-1、HIF在UC组织、UCACRC组织及正常结肠组织中的表达水平，探讨其与血管生成的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用雄性5～6周龄Balb/c小鼠66只，体质量在25～32 g之间，由中国医科大学医学实验动物中心提供。适应性喂养1周，恒温（23±2）℃，恒湿50%±10%，昼夜循环。

1.2 主要试剂

1.2.1 造模试剂：分子量为5 000的DSS，购自Sigma公司；DHM，购自Sigma公司。

1.2.2 免疫组化法试剂：鼠抗鼠VEGF单克隆抗体、兔抗鼠Flk-1多克隆抗体、S-P免疫组化通用型试剂盒和DAB显色剂，购自北京中山生物试剂公司；鼠抗鼠HIF-1a单克隆抗体，购自武汉博士德生物试剂公司；羊抗鼠Ang-2多克隆抗体，购自泉州市蓝图生物科技有限公司；兔抗鼠CD34单克隆抗体，购自北京博枫科生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 造模及分组：配制DMH溶液：将DMH溶于生理盐水中，配制其终浓度为20 mg/kg，用1 mmol/L NaHCO3溶液调整pH值至6.5～7.0之间。配制DSS饮用水：将分子量为5 000的DSS溶于蒸馏水中，配置成5%的DSS溶液。随机将小鼠分为3组：应用DSS诱导法建立UC小鼠模型（UC组，n=23），应用DMH/DSS联合法建立UCACRC小鼠模型（UCACRC组，n=23），同时设立对照组（n=20）。UC 组小鼠以自由饮用5%的DSS饮用水1周+自由饮用蒸馏水1周为1个循环周期；UCACRC组小鼠以腹腔注射法予以20 mg/kg DMH 1次，后自由饮用5%的DSS饮用水1周，继而自由饮用蒸馏水1周，以上过程为1个循环周期；UC组及UCACRC组均重复9个循环周期。对照组予以蒸馏水自由饮用，不作任何处理。

1.3.2 标本采集：分别于第1个循环周期、第5个循环周期于各组随机抽取5只小鼠处死，于第9个循环周期处死各组剩余小鼠。将每例的整段结肠取出，测量其长度，后沿纵轴切开，选取红肿糜烂、溃疡或肿瘤较明显处的病变肠段，分为2份。第1份用生理盐水冲净后，固定于10%甲醛溶液中，常规石蜡包埋、制作组织切片、常规HE染色后封片，于光镜下观察结肠组织病理改变的情况；第2份采用S-P法进行免疫组织化学染色，具体步骤按操作说明书进行，用以检测3组小鼠结肠组织中Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1的表达水平。

1.3.3 造模指标检测

1.3.3.1 疾病活动指数的评估 每日记录小鼠的体质量、大便性状和隐血情况。体质量无下降、大便正常、隐血阴性各记0分；体质量下降＜5%、大便松散、隐血阴性各记1分；体质量下降5%～10%、大便松散、隐血阳性各记2分；体质量下降10%～15%，大便稀便、隐血阳性计3分；体质量下降＞15%、稀便、肉眼血便计4分。将三者的评分相加，记为每只小鼠的疾病活动指数，以评估疾病活动情况。

1.3.3.2 病理组织学损伤评分 在光镜下观察结肠组织切片。无溃疡、无炎症、无肉芽肿、无纤维化、无病变各记0分；小溃疡＜3 mm、轻度炎症、有肉芽肿、病变局限于黏膜下层各记1分；大溃疡＞3 mm、重度炎症病变深度达肌层、重度纤维化各记2分。合计总分，算平均值。

1.3.3.3 不典型增生评价标准 按照Morson等［10］描述的标准将不典型增生分为低度和高度不典型增生；癌变分为原位癌（癌细胞浸润至黏膜层或黏膜下层）和进展期癌（癌细胞浸润至肌层及以外）。

1.3.4 S-P法结果判定：Ang-2蛋白主要定位于胞质，VEGF和Flk-1蛋白主要定位于胞质和（或）细胞膜，HIF-1a蛋白主要定位于胞质和（或）细胞核，以上四者经S-P法免疫组化染色，DAB液显色后均以出现棕黄色颗粒为表达阳性。参照Sinicrope的标准［11］进行半定量积分法判断结果。随机观察5个高倍镜视野，每个视野记数100个肿瘤细胞中阳性细胞的比例，非癌组织则计数着色区100个细胞中阳性细胞的比例。记分如下：（1）按阳性细胞百分比记分：平均阳性细胞的比例<5%，记为0分；5%～25%，记为1分；26%～50%，记为2分；51%～75%，记为3分；>75%，记为4分。（2）按着色强度记分：呈淡黄色者为弱染色，记为1分；呈黄色者为中等染色，记为2分；呈棕黄色者为强染色，记为3分。2个记分的乘积：0分为阴性（-）；1～4分为弱阳性（+）；5～8分为中度阳性（++）；9～12分为强阳性（+++）。

2 结果

2.1 一般情况及疾病活动指数评分

表1 第1、5、9个循环周期末3组小鼠疾病活动指数评分、结肠长度及病理组织学评分Tab.1 Disease activity index，length of colon，and pathohistological index of 3 groups of mice at the end of 1，5，and 9 cycles

UC组及UCACRC组小鼠在第1个循环周期的第3天开始出现精神萎靡、懒动、食量减少、体毛凌乱等症状，第4天有1只小鼠出现大便潜血阳性，第5天有3只小鼠出现体质量下降，其中2只小鼠出现大便次数增多、质稀、肉眼血便。至第1个循环周期末2组小鼠中出现大便松散、稀便、隐血阳性、肉眼血便及脓血便者逐渐增多。改为自由饮用蒸馏水后第1～2天仍可见血便，后血便及腹泻情况逐渐缓解。第5个循环周期开始后第3天即有5只小鼠复现大便隐血阳性，2只复现肉眼血便，且停止饮用DSS饮用水后症状持续时间较前1个循环延长。第9个循环开始后第2天2组中即有所有小鼠出现稀便、肉眼血便、体质量下降，改为自由饮用蒸馏水后5 d仍有腹泻及便血症状。对照组小鼠精神及活动正常，食量无明显改变，体毛柔顺，大便性状及频次正常。第1、5、9个循环周期末各组小鼠疾病活动指数评分见表1。

2.2 光镜下结肠病理组织学评估

UCACRC组及UC组：在第1个循环周期末处死的小鼠中结肠组织有明显的充血水肿，部分黏膜上皮损伤脱落，伴有不同程度的腺体结构消失。第5个循环周期末处死的小鼠中发现多灶性小溃疡，部分组织的浆膜层出现息肉状改变，固有腺体萎缩。第9个循环周期末处死的小鼠中，UC组可见黏膜广泛坏死、糜烂，炎性细胞浸润全层；UCACRC组出现不同程度的不典型增生和癌变的表现，如细胞出现核大深染、核形不规则、核分裂像增多、核质比例增大等，多见于结肠的远端；对照组小鼠结肠黏膜上皮完整，腺体排列规则，无充血水肿及糜烂溃疡。第1、5、9个循环周期末3组小鼠病理组织学损伤评分及结肠长度见表1。第9个循环周期末UCACRC组的不典型增生及癌变率高于对照组及UC组（P＜0.05），UC组不典型增生率高于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 第9个循环周期末3组小鼠结肠肿瘤的发生情况Tab.2 Incidence of colorectal cancer of colon at the end of 9 cycles

2.3 S-P法检测结果

2.3.1 不同类型的结肠组织中血管生成相关因子的表达：4种血管生成相关因子的阳性表达率在UCACRC组织和UC组织中均在62%以上，在正常结肠组织中均不高于10%，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而且UCACRC组织和UC组织相比，除HIF在UCACRC组表达较UC组升高（P＜0.05）外，Ang-2、VEGF、Flk-1的阳性表达率均无统计学差异（P＞0.05）。见表 3。

表3 9个循环周期后血管生成相关因子在不同类型结肠组织中的表达Tab.3 Expression of angiogenesis in the colon tissue of different groups at the end of 9 cycles

2.3.2 UC组不同时期的结肠黏膜中血管生成相关因子的表达：观察第1、5、9个循环周期末UC组小鼠结肠组织中4种血管生成相关因子Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1的表达水平。结果显示，4种血管生成相关因子的阳性表达率随实验周期的增加而增大，第9个循环周期末的阳性表达率与第1个循环周期末相比，均有统计学差异（P＜0.05），与第5个循环周期末相比差异均无统计学意义（P＞0.05）；且第5个循环周期末与第1个循环周期末相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 血管生成相关因子在UC组小鼠不同时期的结肠组织中的表达Tab.4 Expression of angiogenesis in the colon tissue of UC group in different cycles

3 讨论

当今UC的发病率日益增高，其相关性结肠癌的发病率也随之上升，UC相关性癌变逐渐成为当下医学研究的热点之一［12］。此种癌变在炎性肠病中具有高致死率和低发生率的特点，所以在临床收集多个病例难度较大，对其主要的研究手段为建立相应的动物模型，模拟UC发生癌变的过程。本实验拟应用DSS诱导法建立UC小鼠模型，应用DMH/DSS联合法建立UCACRC小鼠模型，结果显示单纯使用DSS可有效建立UC模型小鼠，但该组发生低度不典型增生的概率仅为15.38%（2/13），且未发现癌变者。加用DMH者，即采用DMH/DSS联合法处理的小鼠，多个循环后发生不典型增生和癌变的概率明显提高，可达92.31%（12/13）。由此我们可以认为DMH/DSS多个循环联合应用可以建立较理想的UCACRC小鼠。通过以上2种造模方法，我们可以初步建立UC及其相关癌变的动物模型，从而可对人类UC及其相关癌变的发生、发展机制进行研究，研发相应的治疗药物，预防结肠癌的发生、发展。

UC特别是其相应癌变的发生、发展和转移与血管的新生密切相关。正常情况下，体内血管的生长与抑制处于动态平衡状态，一旦失衡就会导致许多疾病的发生［13］。炎症及癌变过程中血管的新生主要依赖于各种血管生成相关因子的调节，Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1为常见的4种血管生成相关因子。本实验在成功建立动物模型后对以上4种血管生成相关因子的表达水平进行了检测。通过S-P免疫组化方法检测以上四者在结肠炎症组织、癌变组织及正常组织中的表达水平，发现Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1在UC组织、UCACRC组织中呈高表达，其阳性率明显高于正常结肠组织（P＜0.05），且通过比较其在UC组第1个周期末、第5个周期末、第9个周期末3个时期的阳性表达率，发现随着实验周期增加，四者的表达水平均有所增高。

综上所述，采用DSS诱导法及DMH/DSS联合法可建立UC及UCACRC小鼠模型，成功模拟结肠的正常组织—炎症组织—不典型增生—癌变的发展过程。血管生成相关因子Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1在UC及UCACRC的血管生成中起重要作用，与炎症及肿瘤的发生、发展密切相关。特别是HIF在UCACRC中生成表达较UC组升高，表明炎症发生时常造成组织缺血及缺氧，在有致癌因素存在时加重组织异常增生，最终导致组织的恶变。目前血管生成相关因子的作用越来越受到重视，针对抗血管生成药物及相应治疗的探讨已成为医学科研的热点。研究各种血管生成相关因子在UC及其相应癌变中的表达，有助于进一步了解结肠炎—癌改变的发生和发展，同时为抗血管生成治疗提供有力依据。

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