山羊低氧适应性相关基因的表达量研究

肖骁 字向东等

摘要：为了探讨藏山羊低氧生态适应性的分子调节机理，采用实时荧光定量PCR技术对藏山羊和乐至黑山羊低氧诱导因子（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF165）及其受体FLT-1和FLK-1基因的表达量进行测定。结果表明，在垂体组织中，乐至黑山羊hif-1α、vegf165和flk-1的mRNA相对表达量分别是藏山羊的1.43倍、1.93倍和4.25倍，差异显著（P<0.05），flt-1的mRNA相对表达量是藏山羊的1.22倍，无显著差异（P>0.05）；在肝脏组织中，乐至黑山羊hif-1α、vegf165和flt-1的mRNA相对表达量分别是藏山羊的2.08倍、1.52倍和3.21倍，差异显著（P<0.05），flk-1的mRNA相对表达量是藏山羊的1.17倍，无显著差异（P>0.05）。说明经过长期生物进化和环境选择，藏山羊对于高原低氧环境已经表现出明显的适应性，目的基因的表达量均低于乐至黑山羊。

关键词：藏山羊；实时荧光定量PCR；mRNA表达量；低氧适应性

中图分类号：S827 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）09-2181-04

低氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1， HIF-1）是一种能特异性结合于促红细胞生成素基因的低氧反应原件（HRE）的DNA结合蛋白，它广泛参与动物细胞中缺氧诱导产生的适应性反应，是细胞适应低氧的重要蛋白转录调节因子[1]。HIF-1是由对氧敏感的α亚基和稳定表达的β亚基组成的异源二聚体[2]。作为HIF-1的调节亚基和活性亚基，HIF-1α决定HIF-1的活性，实现HIF-1的生物效应。低氧环境下HIF-1α在组织细胞中广泛表达，在某些基因的启动子、增强子或其他调控区也都含有HIF-1α的特异结合序列，这说明在低氧诱导的各种相关基因的表达中HIF-1α起着关键作用[2]。

血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是对血管形成具有重要作用的生长因子。它是内皮细胞特异的丝裂素（Mitogen），能够促进血管内皮细胞有丝分裂的活性。根據VEGF含有氨基酸数量的不同，可以分为VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189和VEGF206

6种亚型[3，4]。其中VEGF165的生物活性最强、含量最多。VEGF有已知的3种受体：VEGFR-1（Fms-like tyrosine kinase，FLT-1），VEGFR-2（Kinase domain region，also referred to as fetal liver kinase，KDR/FLK-1），VEGFR-3（The fms-like tyrosine kinase，FLT-4）[5]。它们均由胞外区、跨膜区以及胞内区组成。其中VEGFR-1与VEGF的亲和力最强，是VEGFR-2的10倍[6，7]。

藏山羊是我国青藏高原的特有畜种，是一个古老的地方山羊品种，迄今为止已有4 000多年的历史。它主要分布在西藏、四川、青海和甘肃等海拔1 500～5 000 m的高寒牧区，具有耐粗饲、抗逆性强的特点，能适应高原地区各种严酷的自然生态条件，是藏族同胞重要的生产资料和生活资料[8]。乐至黑山羊是四川省乐至县经过长期选育而成的优秀地方品种，主要分布在海拔300～600 m的平原地区。近年来对与环境作用相关的功能基因已有越来越深入的了解，关于高原物种环境适应性的研究也有一些报道。有研究发现将对高原低氧、低温环境有着极强适应能力的高原土著品种藏鸡与白来航鸡和寿光鸡两个低地品种进行全期模拟低氧孵化，藏鸡的孵化率显著高于两个低地鸡品种，表现出了高度的耐受低氧环境的能力[9]；将高原鼠兔置于常氧室温条件下适应7 d，Northern杂交检测hif-1α mRNA在多种组织中均有表达，并且表现出明显的组织差异性[10]。本实验旨在通过采用实时荧光定量PCR技术比较高原藏山羊和平原乐至黑山羊HIF-1α、VEGF165及其受体FLT-1和FLK-1基因的mRNA表达量的差异，进而研究处于高寒低氧地区动物的环境适应性和环境因素对其相关基因表达量的作用及影响，为进一步深入了解环境因素与基因表达之间的分子机制和调控机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验动物 实验所用的羊只均为健康成年的母山羊，藏山羊来自四川省理县藏山羊养殖农户；乐至黑山羊购自四川省乐至县天龙科技示范园。分别采集藏山羊和乐至黑山羊的垂体和肝脏组织样本，标记后放入液氮中保存。

1.1.2 试剂及耗材 总RNA提取试剂盒、RNA样品保存液等购自天根生化科技（北京）有限公司；实时荧光定量试剂盒SsoFastTM EvaGreen Supermix、八联管及配套管盖均购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；RT Reagents试剂盒、Ex Taq酶、pMD19-T Vector购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA胶回收试剂盒及耗材均购自美国Axygen公司。

1.2 实验方法

1.2.4 统计分析 应用SPSS 17.0软件的一般线性模型程序进行数据的分析，采用Pfaffle方法处理数据，分析目的基因的相对表达量。不同实验组中mRNA相对表达量的差异显著性通过t-检验进行分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA完整性及纯度检测

所提取的藏山羊和乐至黑山羊总RNA经紫外分光光度计检测，A260 nm/A280 nm均在1.8～2.0之间，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，18 S RNA和28 S RNA条带清晰可见（图1），说明所提取的RNA完整性好，无明显降解，能满足后续实验的要求。

2.2 實时荧光定量PCR扩增结果

2.3 目的基因在2个山羊品种间的相对表达量分析

3 小结与讨论

HIF-1α作为缺氧应答的调控因子能够广泛激活参与缺氧相关生理反应的众多基因，是介导缺氧信号与一系列基因的转录激活的一个重要偶联和调控因子，在缺氧的适应性反应中发挥重要的作用[19，20]。本实验通过研究高原羊和平原羊之间受环境因素调控的基因表达量的差异，对其环境适应性和基因间的相互作用及影响有了更深入的了解，希望能为今后对组织之间表达量差异以及受体作用机制的进一步研究提供理论基础。

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