Rcan2在结直肠癌诊断中的应用

陈苗生　邱晓明

[摘要] 目的 探讨Rcan2在结直肠癌组织中的表达及与临床病理的相互关系。 方法 方便收集该院2012年 1 月— 2017 年 1月期间诊治的炎症性肠病20 例、增生性息肉20例、腺瘤40 例、结直肠癌及其癌旁正常组织80 例，获取标本总RNA，q PCR测定 Rcan2 mRNA 表达水平，对Rcan2 mRNA的差异表达与结直肠癌患者临床病理信息进行相关性分析。体外转染Rcan2基因于结直肠癌colo320DM细胞，MTT实验观察Rcan2過表达对肿瘤细胞增殖的影响。体外转染kras突变基因（G12V）于人结直肠癌细胞中，观察Rcan2基因的表达情况。 结果 结直肠癌组织中Rcan2 mRNA表达量（2.98±0.21）明显高于其他各组。Rcan2 mRNA的表达量与肿瘤大小密切相关 （P <0.01） 。Rcan2-pcdna3.1转染的细胞增长速度慢，OD值从10上升到14，而pcdna3.1转染的细胞增长速度快，OD值从12上升到18 ，过表达kras（G12V）抑制Rcan2基因表达。Rcan2相对表达量从2.8下降到1.1。 结论 这些发现提示Rcan2是一个潜在的结直肠癌诊断指标。

[关键词] Rcan2；实时荧光定量PCR；结直肠癌； mRNA

[中图分类号] R446.1；R730.23 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）08（a）-0005-03

[Abstracts] Objective This paper tries to investigate the expression of Rcan2 in colorectal cancer and its relationship with clinicopathological features. Methods Convenient selection 20 patients with inflammatory bowel disease， 20 cases of hyperplastic polyps， 40 cases of adenoma， 80 cases of colorectal cancer and adjacent normal tissues from January 2012 to January 2017 in this hospital were collected. The total RNA， the expression of Rcan2 mRNA was measured by qPCR， and the difference of Rcan2 mRNA expression was correlated with the clinicopathological information of patients with colorectal cancer. The effect of Rcan2 overexpression on tumor cell proliferation was observed by MTT assay in colorectal cancer colorectal cancer cells transfected with Rcan2 gene in vitro. In vitro transfection of kras mutant gene（G12V） in human colorectal cancer cells， the expression of Rcan2 gene was observed. Results The expression of Rcan2 mRNA in colorectal cancer tissues was （2.98±0.21）， significantly higher than that in other groups. The expression of Rcan2 mRNA was closely related to tumor size （P<0.01）. Rcan2-pcdna3.1 transfected cell growth rate was relatively slow， from 10 to 14， pcdna3.1 transfected cells grew faster， from 12 to 18， overexpression kras （G12V） inhibit expression of Rcan2 gene expression， the relative expression of Rcan2 decreased from 2.8 to 1.1. Conclusion These findings suggest that Rcan2 is a potential diagnostic indicator for colorectal cancer.

[Key words] Rcan2； q PCR； Colorectal cancer； mRNA

结直肠癌是我国常见恶性肿瘤之一，严重影响到人们生活健康[1]，由于发病机制复杂，涉及多个基因，因此了解结直肠癌发生发展机制，找到结直肠癌诊断指标，对有效治疗结直肠癌具有重要意义。Rcan2做为甲状腺激素反应基因率先被报道[2]，之后RCAN家族其它成员的基因功能也相继被报道，其中包括血管生成，抑制内皮细胞的增值和迁移等[3-5]，但是RCAN2在肿瘤中的表达和应用，先前并没有相关报道。该实验运用荧光定量PCR检测Rcan2在腺瘤组织，癌旁正常组织，结直肠癌组织、增生性息肉组织、炎症性肠病组织中的表达水平，并结合结直肠癌的临床病理信息和体外细胞转染等分子层面上的研究，研究该院2012年 1 月— 2017 年 1月期间收治得到80例结直肠癌发展过程中Rcan2作用以及诊断价值，现报道如下。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集该院胃肠外科手术标本，包括腺瘤40 例、炎症性肠病20 例、增生性息肉20例、结直肠癌及其癌旁正常组织80例。以上组织，一份用于RNA的提取，一份做病理检查。病理分期参照第 7 版UICC/AJCC 结直肠癌 TNM 分期标准。结直肠癌患者：年龄30～ 90 岁，中位年龄 60 岁，男46例，女 34 例，肿瘤大小 <5 cm 39例、≥5 cm 41例； 20 例高分化、31例中分化、29例低分化； 49例发生淋巴结转移、未发生淋巴结转移31 例。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂 人结直肠癌细胞株Colo320DM购买于中国科学院、核酸提取试剂盒（生工），荧光定量PCR试剂盒（大连）。RCAN2 mRNA和 GAPDH mRNAqPCR 特异性扩增引物。MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，Rcan2-Pcdan3.1，krasG12V-pcdna3.1

1.2.2 细胞培养与转染 Colo320DM细胞接种于培养瓶中， 10%胎牛血清，RPMI-1640培养基，37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱内培养，当细胞密度达到70%～80%时。将细胞接种于6孔板中，分为2组：转染空载组；转染krasG12V-pcdna3.1组。待细胞密度达到70%～80%时，按照试剂说明，将质粒转进细胞，继续培养48 h，取出提取mRNA。

1.2.3 MTT实验 将两组coloDM320细胞株，转入空载Pcdna3.1的对照组和转入 Rcan2-Pcdna3.1的阳性克隆组分别培养，按试剂说明收集细胞，将细胞接种于 96 孔板，37℃、5% CO2培养箱中培养 8～24 h。去上清，加入新鲜培养基，MTT 溶液，于培养箱中继续培养 4 h。之后去除 MTT，并向每孔加入结晶溶解液，将 96 孔培养板放入酶标仪中，在 490 nm 处检测各孔细胞的吸光值。以时间为横轴，吸光值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测 模板为组织cDNA，GAPDH 进行标准化。引物Rcan2基因，上游： 5'- CTGAGTCCACCCCAAGTGTC-3'，下游：5'- GGACGCCGAGTTTG GATGAT -3'； 内参 GAPDH，上游： 5'-GTCAACGGATTT GGTCTGTATT -3'，下游： 5'-AGTCTTCTGGGTGGCAG TGAT -3'。反应条件为： 95 ℃ 预变性 30 s，95 ℃ 变性 5 s，56℃ 退火加延伸 30 s，共 40 个循环。记录反应的 Ct 值。

1.3 统计方法

此次研究中所涉及的数据均采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，计数资料采用百分率（%）表示，并采用χ2检验，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，并采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Rcan2在结直肠癌组织中高表达

为了研究Rcan2在个组织中的表达情况，该研究收集了炎症性肠病20 例、增生性息肉20例、腺瘤40 例、结直肠癌及其癌旁正常组织80例，获取样本总RNA，实时荧光定量 PCR测定 Rcan2 mRNA的表达水平，根据各组均值做统计分析。如图1所示，与癌旁正常组织相比，直肠癌组织中Rcan2成高表达（P<0.01）。而在炎症性肠病、腺瘤、增生性息肉、癌旁正常组织中，Rcan2表达较低，且表达量差异无统计学意义（P>0.05），结直肠癌组织中Rcan2mRN4表达量（2.98±0.21）明显高于其他各组（图1）。

2.2 RCNA2 mRNA表达量与结直肠癌标本临床病理特征的关系

如表1 显示，肿瘤大小与结直肠癌组织中Rcan2 mRNA表达量显著相关（ P<0.01）。Rcan2 mRNA的表达量与年龄、性别、分化程度、淋巴节转移无相关（P>0.05）。

2.3 Rcan2过表达抑制肿瘤细胞的增值

为了确定Rcan2对肿瘤细胞增值的影响，该研究将Rcan2-pcdna3.1，空载转入colo320DM细胞，培养72 h观察。MTT 法检测细胞的增殖能力，如图2所示，与空载转染的细胞相比，Rcan2-pcdna3.1转染的细胞增长速度相对较慢，这意味着过表达Rcan2对对细胞的增殖能力起到抑制作用。Rcan2-pcdna3.1转染的细胞增长速度慢，OD值从10上升到14，而pcdna3.1转染的细胞增长速度快，OD值从12上升到18 ，过表达kras（G12V）抑制Rcan2基因表達。Rcan2相对表达量从2.8下降到1.1。

2.4 kras突变抑制Rcan2基因表达

大约40%的结直肠癌存在kras基因的突变，为了解kras突变对Rcan2表达量的影响，该研究将krasG12V-pcdna3.1与空载pcdna3.1分别转染colo320DM细胞。培养48 h，提取总RNA。荧光定量pcr检测Rcan2 mRNA表达量。如图4所示，与转染krasG12V-pcdna3.1组相比，空载组Rcan2表达量更高（P<0.01），这表明突变kras抑制Rcan2基因表达。

3 讨论

在中国结直肠癌作为高危癌种，大约有4%～5%的发病风险，而大约又有1/3的结直肠癌患者死于该疾病[6]。结直肠癌发病机制复杂，目前已有相关的基因途径被报道。譬如Wnt-APC通入， Ras-MAPK通路等[7]，mTORC1作为一个重要的蛋白激酶，也与结直肠癌的发生发展密切相关。近期又有相关研究[8-9]报道了Rcan家族与细胞的增值相关，之后研究又报告了Rcan1在肾癌和卵巢癌中血管表达，该研究近期发现家族的另一个成员Rcan2在结直肠癌的肿瘤细胞中表达显著，通过荧光定量 PCR 检测 Rcan2mRNA在结直肠癌，增生性息肉、腺瘤、炎症性肠病及癌旁正常组织中的表达，该研究发现Rcan2的表达水平在结直肠癌组织中高表达且明显高于其他各组。这暗示Rcan2的高表达是结直肠癌的特征之一。此外，该研究又结合临床病理分析，发现高表达的 Rcan2 mRNA 意味着更小体积的肿瘤，随后的MTT的结果进一步说明了上诉的推论。这些结果表明Rcan2 抑制肿瘤的增值。endprint

西妥昔单抗和帕尼单抗作为表皮生长因子受体抗体药物，用于治疗转移性结直肠癌，EGFR作为跨膜酪氨酸激酶受体家族成员，激活RAS-Raf-MAP激酶通路，从而控制细胞的生长、分化和增殖在RAS-Raf-MAP激酶通路中KRAS突变已被报道在是抗EGFR抗体治疗的一个重要的预测指标，因此了解kras的状态与下游分子的相互关系对靶向药物的治疗尤为重要，该次研究发现将kras转染结直肠癌细胞colo320DM，Rcan2的表达量下调，这是否意味着Rcan2参与了耐药机制，或者说Rcan2可能作为潜在的治疗靶点这值得进一步研究[10-11]。

综上所述，该研究结果显示，Rcan2在结直肠癌组织中呈高表达，Rcan2的高表达抑制肿瘤细胞增值，并与肿瘤大小密切相关，此外，进一步研究证实KRAS突变与Rcan2相互关系，揭示了Rcan2可能是一个潜在的治疗靶点。

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（收稿日期：2017-05-08）endprint