植物乳杆菌、戊糖片球菌对产肠毒素金黄色葡萄球菌生长的影响

句荣辉　黄广学　罗红霞等

摘要：研究食盐含量、pH值、温度对产肠毒素金黄色葡萄球菌的生长的影响，并主要研究植物乳杆菌和戊糖片球菌对产肠毒素和不产肠毒素金黄色葡萄球菌生长的影响以及之间的差别。结果表明：植物乳杆菌和戊糖片球菌均能抑制金黄色葡萄球菌的生长，植物乳杆菌的抑菌活性显著高于戊糖片球菌（P<0.05），植物乳干菌和戊糖片球菌对不产肠毒素金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著高于产肠毒素金黄色葡萄球菌（P<0.05）。

关键词：植物乳杆菌；戊糖片球菌；产肠毒素金黄色葡萄球菌；抑菌活性

中图分类号：TS251 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）07-0006-04

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）广泛存在于自然界中，易污染食品，是一种重要的食源性致病菌，是世界范围内的致病菌及食品安全的指示菌[1]。其主要致病因子为肠毒素（staphylococcal enterotoxins，SE）和毒性休克综合征毒素-1（itoxic shock syndrome toxin-1，TSST-1）等[2-3]，引起的食物中毒主要是食用了含有肠毒素的食品[4]。在美国和加拿大由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件分别为33%和45%[5]，在我国关于近几年微生物性食物中毒病例中，20%～25%是由金黄色葡萄球菌引起的[6]。金黄色葡萄球菌导致的食物中毒已成为世界性的公共卫生问题[7]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）能够产生有机酸、过氧化氢、双乙酰、细菌素和抗生素等物质对致病菌和腐败菌具有抑菌或者杀菌的作用[8-9]。已有研究证明，在西式火腿、腌肉和香肠等发酵肉制品的生产中接种乳酸菌可以促进产品风味的形成，缩短腌制时间，改善制品色泽，延长制品的保藏期[10]。乳酸菌中的植物乳杆菌和戊糖片球菌作为常用的肉制品发酵剂，在发酵肉制品中有很大作用[11-12]。植物乳杆菌属于乳杆菌科中的乳杆菌属，属于同型发酵乳酸菌[11]，与人类的生活关系密切，是一种常见于奶油、肉类发酵制品中的乳酸菌，所产植物乳杆菌素能够抑制李斯特菌、沙门菌、金黄色葡萄糖球菌等食源性病原菌[13-14]。戊糖片球菌属于乳酸菌属，也可用作肉品发酵剂，张凤宽等[15]将戊糖片球菌加入发酵香肠中，发现在发酵香肠成熟过程中活菌总数和乳酸菌数显著的增加，能有效抑制有害菌的生长，并显著降低香肠中的亚硝酸盐残留量。

本实验中金黄色葡萄球菌为从鲜肉中分离出的产肠毒素A和E的菌株，具有特殊性。关于植物乳杆菌和戊糖片球菌抑制有害菌的研究有大量的报道，但是对于产肠毒素的金黄色葡萄球菌的抑制作用鲜有报道。本实验主要研究了植物乳杆菌和戊糖片球菌对产肠毒素和不产肠毒素金黄色葡萄球菌生长的影响。

1 材料与方法

1.1 实验菌株与培养基

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）由北京畜牧兽医研究所畜产品加工研究实验室早期实验筛选得到；金黄色葡萄球菌：产肠毒素A和E的金黄色葡萄球菌是从鲜肉中分离出的一株具有代表性的菌株，金黄色葡萄球菌25923购自中国医学微生物菌种保藏管理中心。

MRS液体培养基、MRS固体培养基、营养肉汤液体培养基、Baird-parker琼脂平板、营养琼脂培养基等均购自北京陆桥技术有限责任公司

1.2 仪器与设备

LHS-250恒温恒湿培养箱、DHP-9025型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；Model J-6M冷冻离心机 美国Beckman Coulter有限公司；LDZM-60KCS智能型不锈钢灭菌器 上海申安医疗器械厂；H721型可见分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 食盐含量对金产肠毒素黄色葡萄球菌生长的影响

接种产肠毒素金黄色葡萄球菌于食盐质量分数分别为2%、3%、4%、5%的营养肉汤培养基中，置于37℃条件下振荡培养，每隔2h分别取样测量吸光度，制作金黄色葡萄球菌生长曲线。

1.3.2 温度对产肠毒素金黄色葡萄球菌生长的影响

接种产肠毒素金黄色葡萄球菌于营养肉汤培养基中，然后置于16、22、37℃条件下振荡培养，在0、4、8、12、16、20、24h分别取样进行金黄色葡萄球菌计数，金黄色葡萄球菌计数按照国标GB 4789.10—2010《食品微生物学检验：金黄色葡萄球菌检验》进行。

1.3.3 pH值对产肠毒素金黄色葡萄球菌生长的影响

接种产肠毒素金黄色葡萄球菌于pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5的营养肉汤培养基中，置于37℃条件下振荡培养，每隔2h分别取样测量吸光度，制作金黄色葡萄球菌生长曲线。

1.3.4 戊糖片球菌和植物乳杆菌在不同温度条件下对产肠毒素金黄色葡萄球菌生长的影响

实验分为3组，一组接种金黄色葡萄球菌于营养肉汤培养基中，一组接种金黄色葡萄球菌和植物乳杆菌，一组接种金黄色葡萄球菌和戊糖片球菌，置于16、22、37℃条件下振荡培养，在0、4、8、12、16、20、24h分别取样进行金黄色葡萄球菌计数，金黄色葡萄球菌计数按照GB 4789.10—2010《食品微生物学检验：金黄色葡萄球菌检验》进行。

1.3.5 戊糖片球菌和植物乳杆菌对产与不产肠毒素金黄色葡萄球菌生长的影响

采用双层牛津杯法：将约12mL已灭菌的下层营养琼脂培养基（2%琼脂）冷却至55℃左右，倒入培养皿后静置凝固。灭菌的上层营养琼脂培养基（1%琼脂）冷却到50℃左右，加入1mL 106CFU/g金黄色葡萄球菌菌液混匀，然后将约10mL添加到已凝固的培养基上，静置凝固。用镊子将无菌牛津杯轻轻放入培养皿中，吸取一定浓度的植物乳杆菌和戊糖片球菌菌悬液0.1mL放至牛津杯中，将平板置于37℃中培养24h，测量抑菌圈的直径。

2 结果与分析

2.1 食盐含量对产肠毒素金黄色葡萄球菌生长的影响

由图1可看出，在2%～5%食盐质量分数培养基中，随着食盐含量上升金黄色葡萄球菌数量开始增长所需培养时间越长，这是因为金黄色葡萄球菌需要一段时间适应环境的过程才能生长，但金黄色葡萄球菌数量变化的趋势是一样的，均随生长时间延长而增长。因此在2%～5%食盐质量分数范围内，高质量分数食盐虽能减缓金黄色葡萄球菌的生长，但不能作为有效抑制金黄色葡萄球菌生长的栅栏因子。

2.2 温度对产肠毒素金黄色葡萄球菌生长的影响

由图2可看出，在16～37℃范围内，随温度升高，产肠毒素高金黄色葡萄球菌数量增长的速度越快，16℃时金黄色葡萄球菌数量增长十分缓慢，而37℃时金黄色葡萄球菌增长快速。这说明温度为抑制金黄色葡萄球菌的重要栅栏因子，低温能够抑制金黄色葡萄球菌的生长。

2.3 pH值对产肠毒素金黄色葡萄球菌生长的影响

由图3可看出，pH值为5.5～6.5培养基中，在0～16h内金黄色葡萄球菌均处于快速增长趋势，但16h后金黄色葡萄球菌生长趋于稳定且有小幅度下降，这是因为随时间变化培养基内产生大量代谢产物和营养物质消耗的原因；在pH5.0的培养基中金黄色葡萄球菌增长比较缓慢，因此pH≤5.0时对金黄色葡萄球菌产生抑制作用，pH5.5～6.5范围内不抑制金黄色葡萄球菌。

2.4 戊糖片球菌和植物乳杆菌在不同温度下对产肠毒素金黄色葡萄球菌的影响

由图4可看出，在16～37℃范围内，随着温度的升高，产肠毒素金黄色葡萄球菌增长速度越快，但是在每个温度条件下植物乳杆菌和戊糖片球菌对金黄色葡萄球菌都能够产生相同的抑制效果，植物乳杆菌和戊糖片球菌能够显著影响金黄色葡萄球菌的生长，由此可知，植物乳杆菌和戊糖片球菌是抑制金黄色葡萄球菌的关键栅栏因子。

2.5 植物乳杆菌和戊糖片球菌对产肠毒素与不产肠毒素金黄色葡萄球菌生长的影响

由图5可看出，植物乳杆菌和戊糖片球菌对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈菌直径菌大于10mm，说明植物乳杆菌和戊糖片球菌对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制效果。植物乳杆菌对产肠毒素或不产肠毒素金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径显著高于戊糖片球菌的抑菌圈直径（P<0.05），说明植物乳杆菌对产肠毒素或不产肠毒素金黄色葡萄球菌的抑菌效果高于戊糖片球菌；植物乳杆菌和戊糖片球菌对不产肠毒素金黄色葡萄球菌抑制效果显著好于对产肠毒素金黄色葡萄球菌的抑制效果（P<0.05），说明产肠毒素金黄色葡萄球菌的生长能力或者说存活能力高于不产肠毒素金黄色葡萄球菌，产肠毒素金黄色葡萄球菌更加难以抑制。

3 结 论

在2%～5%食盐质量分数范围内，食盐质量分数不能做为抑制产肠毒素金黄色葡萄球菌的栅栏因子；低温能抑制产肠毒素金黄色葡萄球菌的生长；pH≤5.0时对产肠毒素金黄色葡萄球菌产生抑制作用，pH5.5～6.5时不抑制产肠毒素金黄色葡萄球菌；植物乳杆菌和戊糖片球菌在16～37℃范围内均能明显抑制产肠毒素金黄色葡萄球菌的生长；植物乳杆菌对产肠毒素或不产肠毒素金黄色葡萄球菌的抑制效果显著好于戊糖片球菌（P<0.05），并且植物乳杆菌和戊糖片球菌对不产肠毒素金黄色葡萄球菌抑制效果显著好于对产肠毒素金黄色葡萄球菌的抑制效果；产肠毒素金黄色葡萄球菌的存活能力优于不产肠毒素金黄色葡萄球菌，因此产肠毒素的金黄色葡萄球菌更难抑制。

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