响应面法优化红外制备高凝胶性血浆蛋白粉工艺

凌云霄　江城　郑娟等

摘要：选取麦芽糊精作为羰基供体，采用红外处理诱发血浆蛋白粉与麦芽糊精发生美拉德反应，从而提高血浆蛋白粉凝胶特性。首先以血浆蛋白粉的溶解性、凝胶性以及色差为检测指标，通过单因素试验研究了红外处理时间、温度以及麦芽糊精的添加量对血浆蛋白粉品质的影响，在单因素试验基础上，再采用响应面法优化血浆蛋白粉的加工工艺。结果表明：优化试验的最佳条件为红外温度92℃，红外时间17min，麦芽糊精添加量0.56%，测得其凝胶强度为175.52g/cm2，凝胶强度较对照组68.57g/cm2提高了1.56倍。

关键词：血浆蛋白粉；凝胶性；红外；响应面优化

中图分类号：TS251.6 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）07-0020-06

血液进行分离和喷雾干燥后，可以得到血球蛋白粉和血浆蛋白粉，其中血浆蛋白粉蛋白含量高，氨基酸丰富平衡，是一种等同于全蛋粉的蛋白原料[1-3]。目前国内生产的血浆蛋白粉几乎都是作为动物饲料使用的，而国外生产的血浆蛋白粉已经可以加入食品当中。相比而言，饲料级的血浆蛋白的应用价值不及食品用的血浆蛋白粉。而国产血浆蛋白粉凝胶性不足是导致其品质低于进口产品的一个重要因素。

国内外研究显示，美拉德反应除了可以应用在食品风味还可以应用于接枝反应[4]。对于蛋白质易变性，难于改性的特点，美拉德接枝反应给科研人员提供了新的途径。由于多糖在液相中能够增稠和提高凝胶性，所以多糖的存在增加了胶体的稳定性。于是一些研究者致力于用多糖与蛋白质发生美拉德反应来改善蛋白质的热不稳定性和其他功能特性[5]。因为血浆蛋白的研究与应用较晚，所以关于蛋白质与多糖的美拉德改性反应的研究大多局限于于蛋清粉、大豆分离蛋白等。早期研究表明：蛋清蛋白质与硫酸葡聚糖[6]、葡萄糖[7]、寡聚半乳糖醛酸[8]、半乳甘露聚糖[9]等糖类发生美拉德反应后，其凝胶性质均得到了很大的改善。

从理论上看，美拉德反应第1步为氨基与羰基的缩合生成席夫碱，第2步为席夫碱经过Amadori重排形成Amadori产物。因而血浆蛋白中丰富的氨基酸基团可以与大量的外源羰基（麦芽糊精）缩合发生美拉德反应，所以通过这个反应可以在血浆蛋白粉中引入多糖——麦芽糊精[10]，从而显著增强血浆蛋白粉的凝胶性。但是美拉德反应第3步为裂解反应，理论上可起破坏此处的改性作用，因此，在实际反应过程中，反应进程的控制显得非常重要。通过王玉堃等[11]、苏丹等[12]、徐志军等[13]的研究，可以发现红外技术相比于干热技术在处理效果和处理时间上都要好，所以用红外处理方式引发美拉德反应为一个可行的研究方向。

本实验以溶解性、凝胶性等为考察指标，通过红外加热使得血浆蛋白粉和麦芽糊精混合粉中的氨基与羰基发生美拉德缩合反应，采用响应面法优化出最佳的血浆蛋白粉加工工艺条件。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

冷冻血浆蛋白粉 湖北安陆宝迪肉类食品有限公司。

麦芽糊精（食品级） 上海西王淀粉集团；酒石酸钠、硫酸铜、氢氧化钠均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

B-290型小型喷雾干燥机 瑞士Büchi公司；AM-50型红外烤箱 深圳市辉跃机械设备有限公司；721型可见光分光光度计 上海光谱仪器有限公司；TA-XT Plus物性分析仪 英国Stable Micro Systems公司；CT14RD台式冷冻高速离心机 美国Beckman公司；HH-S恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；FA25高速乳化分散机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司；FA1104N型分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；WSC-S测色色差计 上海笛柏实验有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶解度检测

采用双缩脲法，将1g猪血浆蛋白粉溶于蒸馏水，配成一定pH值（用1mol/L NaOH溶液和1mol/L HCl溶液调节）的溶液100mL（质量浓度10mg/mL），匀浆机搅拌1min，然后4000r/min离心10min，取上清液1mL，加蒸馏水至3mL，再加入3mL双缩脲试剂，静置30min后于540nm波长下测其吸光度，以蒸馏水为参比液。配制质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0mg/mL的牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液，在同样条件下测其吸光度，绘制BSA溶液配制质量浓度与其吸光度的标准曲线，求出标准曲线的标准方程y=ax+b，其中y为BSA配制质量浓度，x为测得的吸光度。因为10mg/mL BSA百分百溶解，所以配制质量浓度为10mg/mL的血浆蛋白粉溶液的实际质量浓度（y）可以由标准方程求出，血浆蛋白粉的溶解度（Y）可由下式计算：Y/%= y/10×100[14]。

双缩脲试剂的配制：将3g酒石酸钠和0.75g硫酸铜溶于250mL蒸馏水。搅拌下缓慢加入150mL10% NaoH溶液，最后定容至500mL。

1.3.2 凝胶强度检测

测试条件为：测试前速5mm/s，测试速度2mm/s，测试后速5mm/s，测试距离为15mm，夹具为直径0.5英寸的圆柱状平头探头，凝胶强度用硬度（Hardness）即探头下压过程中的最大感应力（g/cm2）表示[15]。

凝胶的制备方法：取2.25g蛋白粉放入50mL烧杯中→加入25mL蒸馏水→用高速均质机均质，静置消泡→用保鲜膜封口，并用橡皮筋扎紧→置于80℃水浴加热40min→立即放入冰水中冷却20min→存放于4℃冰箱中过夜→恢复到室温→测定凝胶强度。

1.3.3 色差检测

开机预热30min，校零。把待测的粉末放入测量皿压实。用测色色差计探头进行测量，平行测量3次取其平均值。

1.3.4 血浆蛋白粉制备工艺及步骤

因为新鲜血液无法长时间保鲜，为了保证实验原材料的一致性，所以采用冷冻干燥制备的血浆蛋白粉复溶为浓缩血液，然后再进行改性实验。血浆蛋白粉制备工艺如下：溶解血浆蛋白粉→添加麦芽糊精→过滤→喷雾干燥→称量分装→红外改性→样品检测。

1）溶解血浆蛋白粉：按照10mL蒸馏水溶解1g血浆蛋白粉的比例配置血浆液；2）添加麦芽糊精：向血浆液中加入一定比例的麦芽糊精溶液并搅拌；3）过滤：使用滤布对血浆液进行过滤，除去其中的较大颗粒；4）喷雾干燥：将上述血浆液进行喷雾干燥，获得喷雾干燥血浆蛋白粉；5）称量分装：根据单因素设置的不同水平试验，对喷雾干燥血浆蛋白粉进行称量分装，确保每一水平实验的蛋白粉质量基本相同；6）红外改性：将分装好的蛋白粉放入红外烤箱中进行不同条件的红外改性；7）样品检测：检测改性后样品的溶解度及凝胶性。

1.3.5 单因素试验

1.3.5.1 红外时间对血浆蛋白粉性质的影响

分别在红外时间0、10、20、30、40、50、60、70min等条件下，固定麦芽糊精添加比例2%，红外温度90℃，研究红外时间对血浆蛋白粉性质的影响，并检测其溶解度、凝胶强度和色差。

1.3.5.2 麦芽糊精添加量对血浆蛋白粉性质的影响

固定红外时间为1.3.5.1节中的最优时间，红外温度90℃，研究麦芽糊精添加量对血浆蛋白粉性质的影响。添加水平为：0.00%、0.25%、0.50%、1.00%、2.00%、4.00%。

1.3.5.3 红外温度对血浆蛋白粉性质的影响

固定红外时间为1.3.5.1节中的最优时间，麦芽糊精添加比例为1.3.5.2节中的最佳添加比例，研究红外温度对血浆蛋白粉性质的影响。温度水平为：0（未红外处理）、70、80、90、100、110℃。

1.3.6 响应面试验

通过单因素试验，得出各因素最优水平，以凝胶性最为响应值，对红外时间，红外温度与麦芽糊精添加量3个因素设计试验，使用Design Expert8.05软件进行3因素3水平响应面试验。

2 结果与分析

2.1 BSA标准侧曲线的测定与绘制

以1.0mg/mL为质量浓度梯度，10mg/mL为最大质量浓度，依次配置10个不同质量浓度的BSA溶液。每组设置3个平行进行吸光度测定。以每组3个平行测定的吸光度的平均值为x轴，以BSA质量浓度为y轴来绘制BSA标准曲线。

由图1可知，随着BSA质量浓度的增加，相应的吸光度也在增加，并且两者有着线性关系。根据相关数据由Excel软件程序可以计算出其标准曲线，求解出标准方程为y=25.871x-0.8073，其中y为BSA质量浓度，x为测得的吸光度。标准方程的相关系数为0.9985，所以可以使用。

2.2 红外时间对血浆蛋白粉的影响

2.2.1 红外时间对血浆蛋白粉溶解度的影响

由图2可知，随着红外时间的延长，血浆蛋白的溶解度先上升后下降，在60min以前其改性后的溶解度都高于原始样，并且在20min时达到最高值，随后逐渐下降，尤其是是红外时间超过60min之后，改性后的血浆蛋白粉的溶解度急速下降，这可能是红外时间加热过长之后血浆蛋白变性造成的，因为血浆蛋白的变性温度就在70～80℃之间。根据数据分析（F检验）显示，红外时间对血浆蛋白粉的溶解度影响显著。

2.2.2 红外时间对血浆蛋白粉色泽的影响

红外时间对血浆蛋白粉色泽的影响试验结果如图3所示。其中L值表示亮度，B值表示黄度。

由图3可知，虽然数据变动幅度很小，但是趋势很明显。随着红外时间的延长，血浆蛋白粉的亮度值缓慢减小，而其黄度值缓慢变大。这是因为随着时间的加长，美拉德反应的第3步反应产物越来越多，导致血浆蛋白粉的亮度下降，黄度增加。根据数据分析（F检验）显示，红外时间对血浆蛋白粉的亮度与黄度影响显著。

2.2.3 红外时间对血浆蛋白粉凝胶性的影响

由图4可知，随着红外时间的延长，血浆蛋白粉的凝胶性先升高后下降，在20min时取得峰值。当红外时间超过60min后，其凝胶强度会低于原始样的凝胶强度，可见红外时间过长时会对血浆蛋白粉起到负面作用的。根据数据分析（F检验）显示，红外时间对血浆蛋白粉的凝胶性影响显著。

由图2～4可知，红外时间为20min时对血浆蛋白粉的改性效果较优，所以后续单因素试验红外时间固定为20min。

2.3 麦芽糊精添加量对血浆蛋白粉的影响

2.3.1 麦芽糊精添加量对血浆蛋白粉溶解度的影响

由图5可知，随着麦芽糊精添加量的增加血浆蛋白粉的溶解度先增加后降低，在添加比例达到0.5%时出现峰值。当麦芽糊精添加量超过1.0%后，血浆蛋白粉的溶解度会迅速下降并且低于原始样。这可能的原因是美拉德反应进入了第3步。根据数据分析（F检验）显示，麦芽糊精添加量对血浆蛋白粉的溶解度影响显著。

图5与图2对比分析，图5中麦芽糊精添加量为0.00%的血浆蛋白粉的溶解度为94.02%，图2中红外时间为0min的血浆蛋白粉的溶解度为85.32%，所以不加麦芽糊精红外处理后的血浆蛋白粉比添加麦芽糊精而不红外处理的血浆蛋白粉的溶解度好，可以推测麦芽糊精对血浆蛋白粉溶解度的影响与美拉德反应有关。

2.3.2 麦芽糊精添加量对血浆蛋白粉色泽的影响

从图6可知，随着麦芽糊精添加量的增加，血浆蛋白粉的亮度与黄度值会出现小范围的改变。亮度值先增加后下降，在添加量为0.5%时取得最大值，而黄度值则是一直增加。因为美拉德反应的第3步是最终的反应，所以增加黄度的美拉德反应产物会不断的积聚，所以黄度值会一直增加。而其亮度的波动，应该是因为反应底物浓度（羰基）在临界点附近的改变而造成的。根据数据分析（F检验）显示，麦芽糊精添加量对血浆蛋白粉的亮度与黄度影响显著。

2.3.3 麦芽糊精添加量对血浆蛋白粉凝胶性的影响

由图7可知，随着麦芽糊精添加量的增加，血浆蛋白粉的凝胶强度先上升后下降，在添加量为0.5%时取得极值。而当麦芽糊精的添加量达到4%时，其改性血浆蛋白粉的凝胶强度将低于原始样的凝胶强度。可见麦芽糊精添加量过大会起到负面作用。根据数据分析（F检验）显示，麦芽糊精添加量对血浆蛋白粉的凝胶性影响显著。

由图5～7可知，麦芽糊精添加量为0.5%时对血浆蛋白粉的改性效果较优，所以后面的单因素试验麦芽糊精添加量固定为0.5%。

2.4 红外温度对血浆蛋白粉的影响

2.4.1 红外温度对血浆蛋白粉溶解度的影响

由图8可知，随着红外温度的增加，血浆蛋白粉的溶解度会出现2个波峰，但是在110℃以内，红外处理的血浆蛋白粉和原始样对比溶解度都是提高的。由试验数据可知，在红外处理温度为100℃时，血浆蛋白粉的溶解度有最高值，为95.24%。根据数据分析（F检验）显示，红外温度对血浆蛋白粉的溶解度影响显著。

2.4.2 红外温度对血浆蛋白粉色泽的影响

由图9可知，随着红外温度的改变，血浆蛋白粉的亮度与黄度会出现小幅度的改变，其中亮度缓慢减小，黄度缓慢增加，这个趋势与图5类似，都是由于美拉德反应进程而改变的。根据数据分析（F检验）显示，红外温度对血浆蛋白粉的亮度与黄度影响显著。

由图3、6、9可知，红外改性对血浆蛋白粉的影响趋势为亮度减小、黄度增大，并且变化幅度很小。这是由于美拉德反应的最终产物包含褐变物质，而褐变必然要降低其亮度，增加其黄度，所以色差对改性血浆蛋白的性质评价意义也不大。但是在考察麦芽糊精添加量时，得到的临界值0.5%周围数值有一定参考意义。

2.4.3 红外温度对血浆蛋白粉凝胶性的影响

由图10可知，随着红外温度的加大，血浆蛋白粉的凝胶强度先增大后减小。在90℃时达到最大值，而当红外温度大于100℃后，其凝胶强度将会低于原始样的凝胶强度。这是美拉德反应由第3步占据主导地位后导致的。根据数据分析（F检验）显示，红外温度对血浆蛋白粉的凝胶性影响显著。

由图8～10可知，红外温度对血浆蛋白粉的色差影响不大；在100℃时其溶解度最大，但是前后溶解度差值很小；在90℃时其凝胶强度最大，并且前后测量值的差值很大。所以选取90℃为最佳红外温度。

由3个单因素试验可知，美拉德反应的前期是可以起到改善作用的，但是到了反应中期以后就会产生负面作用。3个单因素试验得到的最优条件红外时间20min、麦芽糊精添加量0.5%、红外温度90℃。虽然3个单因素试验都显著，但是因为其实际计算得到的溶解度除时间因素之外都是波动在0.05以内，原因可能为未变性的血浆蛋白粉溶解度很高，所以红外改性对于血浆蛋白粉的溶解度的优化作用相对较小[7]，因此溶解度不能成为评判改性效果的主要因素。又因为2.4.2节分析得出结论：色差对改性血浆蛋白的性质评价意义也不大，所以将凝胶强度作为后续响应面试验考察的唯一指标。

2.5 响应面结果与分析

利用Design-Expert8.0软件，对表1试验数据进行回归分析，得到温度（A）、时间（B）、麦芽糊精添加量（C）的二次回归方程为：

凝胶强度/（g/cm2）=―1982.62491+41.59953A+20.40346B+245.78780C―0.13285AB―0.83909AC―5.01747BC―0.21085A2―0.16003B2―75.49142C2

该模型的方差分析结果见表2。

由表1、2可知，红外温度P<0.05，红外时间P>0.05，麦芽糊精添加量P>0.05。说明红外温度对凝胶性的影响显著，而红外时间和麦芽糊精添加量的影响相对较小，则各因素影响凝胶性的大小顺序为：红外温度>红外时间>麦芽糊精添加量。失拟项不显著即该模型在整个研究回归区域拟合的较好。

由响应面软件运算得到的推荐条件为：红外温度92.29℃，红外时间16.62min，麦芽糊精添加量0.56%，推导出的凝胶强度为175.759g/cm2。实际操作将工艺条件修正为：红外温度92℃，红外时间17min，麦芽糊精添加量0.56%。验证实验结果表明：在红外温度93℃、红外时间17min、麦芽糊精添加量0.56%时，测得其凝胶强度为175.52g/cm2，基本吻合。

3 结 论

3.1 红外能够改善血浆蛋白粉的性质，其对改性血浆蛋白粉的溶解度和凝胶性有的改善作用，但是时间过长后会起负面影响，其对于血浆蛋白粉的色差影响不大。当红外时间为20min时，改性血浆蛋白粉的溶解度与凝胶性都取得最好值。

3.2 随着麦芽糊精的添加比例的增加，其对改性血浆蛋白粉的溶解度、色差、凝胶性的影响都是先升高后降低，当麦芽糊精添加比例为0.5%时，改性血浆蛋白粉的溶解度，亮度与凝胶性都会取到最优值。

3.3 当红外温度为100℃时，改性血浆蛋白粉的溶解度最好。但当红外温度为90℃时，改性血浆蛋白粉的凝胶性最好。由于改性血浆蛋白粉的溶解度随着红外温度的变化波动在0.05以内，而红外温度对于改性血浆蛋白粉的凝胶性的改变波动很大，所以参考下还是选择90℃为最优单因素温度条件。

3.4 通过响应面优化试验，推导出最优红外改性工艺条件，并通过验证实验进行验证。得出的最优条件为红外温度92℃、红外时间17min、麦芽糊精添加量0.56%，在此最佳条件下，血浆蛋白粉的凝胶值为175.52g/cm2，凝胶强度较对照组68.57g/cm2提高了1.56倍。

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