E-cadherin、CD44v6、MMP2在膀胱尿路上皮癌中的表达及意义

2013-04-18周美玲许励汤琪乐徐文娟茹国庆

浙江医学 2013年22期

周美玲许励汤琪乐徐文娟茹国庆

周美玲许励汤琪乐徐文娟茹国庆

目的研究钙黏附分子E-cadherin（E-cad）、CD44变异体6（CD44v6）和基质金属蛋白酶（MMP2）在膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma）中的表达及对预后的意义。方法应用免疫组化Envision法，检测105例膀胱尿路上皮癌患者和20例正常体检者膀胱黏膜E-cad、CD44v6及MMP2的表达情况。结果 20例正常膀胱黏膜中E-cad、CD44v6均正常表达，MMP2均阴性表达，105例膀胱尿路上皮癌中E-cad及CD44v6的异常表达率分别为43．8%（46/105）和58．1%（61/105），MMP2阳性表达为53．3%（56/105）。E-cad、CD44v6的异常表达率和MMP2的阳性表达率与患者肿瘤的病理分级、临床分期及生存率相关。结论E-cad、CD44v6的异常表达和MMP2的阳性表达在膀胱尿路上皮癌的演变过程中起着重要作用，可作为监测肿瘤恶性程度和预后有效的分子生物学指标之一。

钙黏附分子 CD44变异体6 基质金属蛋白酶膀胱尿路上皮癌

肿瘤细胞的浸润和转移必须首先脱离原发灶，黏附在细胞外基质上，然后降解基质并通过降解的基质进行移动，穿透基底膜进入间质或体液循环而发挥作用[1]。因此，细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的黏附和相互作用及基底膜的完整是十分重要的。本研究应用免疫组化Envision法检测钙黏附分子E-cadherin（E-cad）、CD44变异体6（CD44v6）的异常表达及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase-2，MMP2）过度表达与膀胱尿路上皮癌浸润能力及预后的关系。

1 资料和方法

1.1 资料来源收集1984—2010年浙江省人民医院病理科90例和杭州钢铁集团公司职工医院病理科15例膀胱尿路上皮癌患者的膀胱黏膜标本共105例，另选择20例正常体检者膀胱黏膜作为对照组，依据2004版WHO的尿路上皮肿瘤分类标准进行病理分类；非浸润性乳头状尿路上皮癌（低级别）33例，非浸润性乳头状尿路上皮癌（高级别）41例；浸润性尿路上皮癌31例，按UICC.TNM标准分期Ta 41例，T131例，T214例，T315例，T44例。标本均由10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋、常规切片。对所有患者进行随访，其中失访25例（23.81%）。

1.2 方法应用免疫组化Envision法，一抗选用鼠抗人E-cad、CD44v6、MMP2单克隆抗体，试剂是由福州迈新试剂公司提供的美国ZYMED公司产品，抗体效价分别为1∶80、1∶50、1∶100。切片常规脱蜡、水化，Tris液（pH6.0）行微波抗原修复。用已知胃癌阳性切片作阳性对照，阴性对照中一抗用PBS取代。常规操作，DAB染色。

1.3 结果判定阳性结果判定：E-cad、CD44v6在细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性：（1）正常表达（++）：切片阳性细胞数≥90%，（2）异常表达（-/+）：（-）切片内无阳性细胞，（+）切片内阳性细胞数＜90%。MMP2以细胞质有明显棕黄色颗粒为阳性。阴性（-）：无阳性细胞；弱阳性（+）：阳性细胞≤10%；阳性（++）：阳性细胞数为10%～75%；强阳性（+++）：阳性细胞数≥75%。

1.4 统计学处理采用SPSS17.0统计软件，E-cad、CD44v6、MMP2在非浸润性乳头状尿路上皮癌（低级别），非浸润性乳头状尿路上皮癌（高级别）和浸润性尿路上皮癌及不同临床病理分期间的表达对比分析采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线作图。

2 结果

2.1 E-cad、CD44v6和MMP2在膀胱尿路上皮癌中的表达 20例正常膀胱黏膜E-cad、CD44v6均呈正常表达，细胞膜为深棕色，分布于细胞交界区，特别是细胞黏附区，20例膀胱正常黏膜MMP2为阴性，细胞质内无深棕色颗粒。E-cad及CD44v6在膀胱尿路上皮癌中表达具有明显异质性，细胞膜染色减少或消失，胞膜、胞质染色交错分布，其异常表达率分别为43.8%（46/105）和58.1%（61/105）。MMP2阳性表达率为53.3%（56/105），细胞质有明显棕黄色颗粒。

2.2 E-cad、CD44v6和MMP2表达与膀胱尿路上皮癌病理分级及患者临床分期的关系非浸润性乳头状尿路上皮癌（低级别）、非浸润性乳头状尿路上皮癌（高级别）及浸润性尿路上皮癌中E-cad异常表达率分别为12.1%（4/33）、46.3%（19/41）、74.2%（23/31），3组的异常表达率有统计学差异（χ2=26.14，P＜0.01）；CD44v6异常表达率分别为24.2%（8/33）、61%（25/41）、90.3%（28/31），3组的异常表达率有统计学差异（χ2=56.76，P＜0.01）。E-cad在浸润性（T2～T4）膀胱尿路上皮癌中的异常表达率[72.7%（24/33）]明显高于浅表性（Ta～T1）膀胱尿路上皮癌[33.3%（24/72）]，两组间异常表达率有统计学差异（χ2=28.97，P＜0.01）。CD44v6在浸润性（T2～T4）膀胱尿路上皮癌中的异常表达率[87.9%（29/33）]明显高于浅表性（Ta～T1）膀胱尿路上皮癌[45.8%（33/72）]，两组间异常表达率有统计学差异（χ2=27.08，P＜0.01）。

MMP2在膀胱非浸润乳头状尿路上皮癌（低级别）中阳性表达为24.2%（8/33），大部分基底膜呈强阳性，阳性表达较均匀；膀胱非浸润乳头状尿路上皮癌（高级别）阳性表达为58.5%（24/41），基底膜阳性表达不均匀；膀胱浸润性尿路上皮癌阳性表达为77.4%（24/31），肿瘤细胞表达强度不均匀，肿瘤间质阳性强度不均匀，与肿瘤细胞邻接处表达较强，有统计学差异（χ2=53.62，P＜0.01）。Ta～T1为44.4%（32/72），T2～T4为72.7%（24/ 33），肿瘤细胞周围间质呈强阳性，有统计学差异（χ2= 19.99，P＜0.01）。

2.3 E-cad、CD44v6和MMP2表达与患者预后的关系 80例获随访患者，E-cad异常表达组5年生存率为67.4%（31/46），正常表达组91.2%（31/34）（P＜0.01）；CD44v6异常表达组5年生存率为68.9%（31/45），正常表达组88.6%（31/35）（P＜0.05）；MMP2阳性表达组5年生存率为70.4%（38/54），阴性组92.3%（24/26）（P＜0.05），其生存曲线见图1-3。

图1 E-cad异常表达与正常表达的膀胱尿路上皮癌患者生存曲线

3 讨论

E-cad是一种介导细胞钙黏附依赖性的跨膜糖蛋白，编码基因定位于16q，它能与Ca2+特异性结合而发挥功能[1]。在肿瘤组织中的表达缺失或降低可导致肿瘤细胞间的黏附力降低,从而促使肿瘤细胞的脱落和转移[2]。武玉东等[3]研究也证实了在膀胱尿路上皮癌中E-cad介导的细胞黏附能力减弱或消失。Shino等[4]报道在胃癌非肿瘤区E-cad表达正常，在未分化癌及转移癌中E-cad表达异常。Ross等[5]报道膀胱癌E-cad表达减弱与肿瘤高分期和进展有关，非浸润型尿路上皮癌与浸润型尿路上皮癌相比后者E-cad表达明显减弱。本组研究结果显示，正常膀胱黏膜细胞膜着色均匀致密，说明细胞间黏附分子的定位及含量均正常，细胞间黏附性强，因而细胞不易脱落，尤其在细胞与细胞的连接部位更为明显。随着尿路上皮癌的分级和分期的增加细胞间的黏附性降低，E-cad的异常表达率亦明显增加，这与文献报道一致。

图2 CD44v6异常表达与正常表达的膀胱尿路上皮癌患者生存曲线

图3 MMP2阳性表达与阴性表达的膀胱尿路上皮癌患者生存曲线

CD44是一种穿膜糖蛋白，属于细胞黏附分子家族成员，其中异构体CD44v6与肿瘤浸润和转移密切相关。Ross等[6]认为这与CD44v6在同型细胞间黏附作用有关，细胞-细胞，细胞-基质间黏附性的丧失可能会促使肿瘤逆分化及促进肿瘤细胞侵袭性，导致肿瘤的远处转移。本实验提示：尿路上皮癌中CD44v6的表达与组织学分级有显著相关性。肿瘤分化越差,CD44v6异常表达越明显；细胞间的黏附力降低，侵袭能力增加，肌层浸润及复发转移率增加。因此，CD44v6的检测将有助于尿路上皮癌的早期诊断和预后评估。

正常基底膜主要由Ⅳ型胶原等构成，为一致密的网状结构，细胞不能自由通过。肿瘤细胞必须借助某些酶类，使基底膜成分有限降解形成小的孔隙并在其他有关因子的作用下完成穿透过程[7]。Bianco等[8]报道浸润性尿路上皮癌MMP2表达强度明显高于非浸润性尿路上皮癌。本实验亦显示，MMP2在非浸润性尿路上皮癌中的阳性表达率低于浸润性尿路上皮癌，此结果说明肿瘤细胞本身分泌MMP2较多，且随着肿瘤的分级增高其分泌增多，侵袭能力增强。有研究表明[9-10]，随着病理分级和分期的增加MMP2表达显著增强，提示MMP2阳性表达与尿路上皮癌的侵袭能力有关。本实验中T2～T4期浸润性膀胱尿路上皮癌中MMP2均为强阳性表达，阳性颗粒分布不均明显高于Ta～T1，表明瘤细胞分泌MMP2在浸润中起着关键作用。这提示在膀胱尿路上皮癌的进展和分化过程中，肿瘤分化程度越低,肿瘤细胞分泌MMP2越多,其浸润和转移的能力亦越强。MMP2的表达随肿瘤分级增高而增强的同时,随肿瘤分期的增高也相应增强,说明MMP2在基底膜降解、肿瘤侵袭和转移过程中将起到更为重要的作用，也可作为判断膀胱尿路上皮癌进展及预后的有效指标。

癌细胞能分泌一些蛋白酶，分解细胞基底膜，其中最主要的是金属蛋白酶，癌细胞浸润和转移必须突破腺体、血管或淋巴管的基底膜进入间质或循环而达到浸润和转移的目的。膀胱尿路上皮癌多呈乳头状向腔内生长，黏附性差，易于脱落和复发。肿瘤切除后，在同一部位或不同部位再发，且其恶性程度往往比原发瘤更高、更具有侵袭性。其预后与肿瘤的浸润深度和复发转移的发生率密切相关。本文随访资料显示E-cad、CD44v6异常表达组，5年生存率低于正常表达组；MMP2阳性表达组5年生存率显著低于阴性组，提示E-cad、CD44v6的异常表达及MMP2阳性表达，有助于判断膀胱肿瘤复发及预后，以便于临床采取有效的治疗措施。

[1]崔珍,彭开桂,沈学明,等．E-钙黏蛋白在食管鳞癌中的表达及其治疗意义[J]．蚌埠医学院学报,2010,35(5):448-450．

[2]Graff J R,Gabrielson E,Fujii H,et al．Methylation patterns of the E-cadherin 59CpG is land are unstable and reflect the dynamic, hetero geneous loss of E-cadherin expression during metastatic progression[J]．J Biol Chem,2000,275(4):2727-2732．

[3]武玉东,魏金星,李中凌,等．钙粘蛋白E在膀胱移行细胞癌中的表达及意义[J]．中华实验外科杂志,1999,16(1):8-9．

[4]Shino Y,Watana A,Yamada Y,et al．Clinicopathologic evaluation of immunohistochemical E-cadherin expression in human gastriccarcinomas[J]．Cancer,1995,76(11):2193-2201．

[5]Ross J S,del Rosario A D,Figgeb H L,et al．E-cadherin expression in papillary transitional cell carcinoma of the urinary bladder[J]．Hum Pathol,1995,26(9):940-944．

[6]Ross J S,del Rosario A D,Bui H X,et al．Expression of the CD44cell adhesion molecule in urinary bladder transitional cell carcinoma[J]．Mod Pathology,1996,9(8):854-860．

[7]Ray J M,Stetler-Stevenson W G．The role of matrix metalloproteinases and their inhibitors in tumor invasion,metatasis and angiogenesis[J]．Eur Respir J,1994,7(11):2062-2072．

[8]Bianco F J,Gervasi D C,Tiguert R,et al．Matrix metalloproteinasa-9 expression in bladder washes form bladder cancer patients predicts pathological stage and grade[J]．Clin Cancer Res,1998,4(12):3011-3016．

[9]Papathoma A S,Petraki C,Grigorakis A,et al．Prognostic significance of matrix metalloproteinases 2 and 9 in bladder cancer[J]．Anticancer Res,2000,20(3B):2009-2013．

[10]Kanayama H,Yokota K,Kurokawa Y,et al．Prognostic values of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expression in bladder cancer[J]．Cancer,1998,82 (7):1359-1366．

Expression of E-cadherin,CD44v6 and matrix metalloproteinase-2 in bladder urothelial carcinoma and its significance

Objective To investigate the expression of E-cadherin(E-cad),CD44v6 and matrix metalloproteinase-2 (MMP2)in bladder urothelial carcinoma and its clinical significance． Methods The expression of E-cad,CD44v6 and MMP2 was detected by mmunohistochemistry Envision method in 105 specimens of bladderurothelial carcinoma and 20 specimens of normal bladder tissue．Results E-cad and CD44v6 were positive and MMP2 was negative in all 20 specimens of normal bladder tissue．E-cad and CD44v6 were positively stained in 43．8%(46/105)and 58．1%（61/105）of bladder urothelial carcinoma specimens,respectively．The positive expression rate of MMP2 was 53．3%(56/105)．There was a positive correlation between the expression of E-cad and CD44v6．The abnormal expression rates of E-cad,CD44v6 and positive expression rate of MMP2 were significantly correlated with the pathologic grades,clinical stages,high recurrence rate and poor survival．Conclusion The expressions of E-cad,CD44v6 and MMP2 may be associated with malignant progression of bladder urothelial carcinoma and these proteins might be used as molecular markers for tumor progression,recurrence and prognosis．

E-cad CD44v6 MMP2 Bladder urothelial carcinoma