人信号传导及转录激活因子shRNA载体的构建与鉴定

徐伶 杨宗兴 陈峰 虞容 杨劲 孟忠华

人信号传导及转录激活因子shRNA载体的构建与鉴定

徐伶 杨宗兴 陈峰 虞容 杨劲 孟忠华

目的 构建针对人信号传导及转录激活因子1（STAT1）基因的shRNA表达载体，检测其对STAT1基因的沉默效果。 方法 设计针对STAT1的shRNA序列，克隆到pGPU6质粒载体，并进行测序、转染和鉴定。 结果 DNA测序显示成功构建了4个shRNA表达载体。shRNA能有效抑制STAT1基因在人宫颈癌细胞株TZM-bl细胞中的表达，抑制率为63%。 结论 成功构建了针对人STAT1基因的shRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA STAT1。

RNA干扰 人信号传导及转录激活因子1 小发夹状RNA

自发现RNA干扰（RNA interference，RNAi）现象以来，利用模拟内源生发途径的小发夹状RNA（short hairpin RNAs，shRNAs）沉默靶基因的表达已成为研究基因功能的一项基准技术。与传统的小干扰RNA（siRNA）相比，shRNA的优势在于能够稳定整合有利于长期表达，包装病毒可转染难以转染的靶细胞或组织，并可设置诱导型启动子等[1]。信号传导及转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription-1, STAT1）是病毒感染中干扰素反应的关键中介子之一。本研究拟初步建立STAT1-shRNA克隆，以期为观察STAT1的生物学功能提供工具。

1 材料和方法

1.1 材料 核酸抽提试剂盒、Taq酶和逆转录试剂盒购自美国Promega公司。XhoⅠ、BamHⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自美国New England Biolabs公司。去内毒素质粒 DMEM培养基、Trizol、Lipofectamine2000、Fugene转染试剂购自美国 Invitrogen或Roche公司。pGPU6/GFP/Neo质粒购自上海吉玛公司。表达CD4、CXCR4、CCR5的人宫颈癌细胞株TZM-bl细胞购于中科院上海巴斯德研究所。DH5α菌种为本室保存。STAT1和GAPDH抗体购自美国Cell signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA靶序列的设计 根据shRNA设计原则及STAT1（Gene bank：NM_007315）cDNA序列，使用DNA oligo等工具辅助定位潜在靶向序列，设计针对STAT1基因编码区序列中的3段序列（645-665、2376-2396、2617-2637）的干扰靶序列，同时建立阴性对照（NC）。所有序列经使用BLAST和相应的人基因组数据库进行比较，排除同源性后提交Invitrogen公司合成。STAT1-sh1序列上游：5′-TCGAGCAAGCGTAATCTTCAGGATATTCAAGAGATATCCTGAAGATTACGCTTGCTT-TTTTG-3′，下游：5′-GATCCAAAAAAGCAAGCGTAATCTTCAGGATATCTCTTGAATATCCTGAAGATTACGCTTGC-3′；STAT1-sh2序列上游：5′-TCGAGCCCTGAAGTATCTGTATCCAATTCAAGAGATTGGATACAGATACTTCAGG GTTTTTTG-3′，下游：5′-GATCCAAAAAACCCTGAAGTATCTGTATCCAATCTCTTGAATTGGATACAGATACTTC AGGGC-3′；STAT1-sh3序列上游：5′-TCGAGCGACAGTATGATGAACACAGTTTCAAGAGAACTGTGTTCATCATACTGTCGTTTTTTG-3′，下游：5′-GATCCAAAAAACGACAGTATGATGAACACAGTTCTCTTGAAACTGTGTTCATCATACTGTCGC-3′；阴性对照 STAT1-NC序列上游：5′-TCGAGCTCCCGTGAATTGGAATCCTTTCAAGAGAAGGATTCCAATTCACGGGAGCTTTTTTG-3′，下游：5′-GATCCAAAAAAGCTCCCGTGAATTGGAATCCTTCTCTTGAAAGGATTCCAATTCACGGGAGC-3′。其中序列TCGA及GATC分别是XhoⅠ、BamHⅠ酶切后粘端；shRNA模板loop结构选用TTCAAGAGA，shRNA的转录终止序列采用T6结构。

1.2.2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA STAT1真核表达载体的构建 化学合成shRNA的正义链和反义链100μM，分别取5μl正、反义寡核苷酸，2μl 10×退火缓冲液（30mM Hepes，pH 7.4，100 mM醋酸钾，2mM醋酸镁）及8μl水。煮沸4min，室温放置15min后置于4℃10～15min。将退火处理后的shRNA模板稀释2 500倍，终浓度为 10nM/L用于连接反应。将退火后的双链shRNA模板和pGPU6/GFP/Neo载体于22℃连接过夜。用连接产物转化感受态E.coli DH5α，在卡那霉素抗性平板上筛选重组质粒载体。各平板随机取2克隆摇菌后进行DNA序列测定。

1.2.3 STAT1 shRNA质粒的细胞转染 用去内毒素质粒提取试剂盒提取测序正确的各组质粒。以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养TZM-bl细胞。待细胞生长良好时，将细胞以5×105/孔接种于6孔板。随机将其分为实验组1～3（分别转染pSTAT1-sh1～3），空白对照组（无细胞组）及阴性对照组（转染pSTAT1-NC）。每孔加入4μg质粒，10μl脂质体。转染6h后，更换为含10%胎牛血清的无抗生素培养基。转染后24～48h倒置荧光显微镜下观察荧光蛋白表达情况。

1.2.4 Western blot检测STAT1蛋白表达 提取细胞总蛋白，上样检测，化学发光试剂显色，胶片贴近曝光，显影、定影后用quantity one图像分析软件分析各组蛋白条带的光密度值。试验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件。计量资料多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 重组质粒的鉴定 采用HPLC纯化的合成寡核苷酸经退火后直接连接经XhoⅠ、BamHⅠ酶切的质粒。测序结果显示，随机挑选的各平板克隆中均含有正确重组的质粒载体。重组质粒分别命名为pSTAT1-sh1、pSTAT1-sh2、pSTAT1-sh3和pSTAT1-NC，见图1。

2.2 瞬时转染与荧光蛋白表达的观察 将转染后细胞置于倒置荧光显微镜下以波长488nm的蓝光激发，在同一视野下观察。转染后24h，实验组1～3及阴性对照组细胞均表达绿色荧光，均匀分布于整个细胞，转染率均＞80%，各组间无明显不同，空白对照组细胞无荧光表达，见插页图2。

图2 倒置荧光显微镜下观察转染效果及荧光蛋白表达（A-D：未激发时各组TZM-bl细胞，B×60，其余×20；E-F：转染pSTAT1-sh2的TZM-bl细胞，E×20，F×60；G：转染STAT1-NC的TZM-bl细胞，×20；H：空白对照组）

2.3 重组质粒对STAT1蛋白表达水平的影响 Western blot检测结果提示重组质粒pSTAT1-sh3转染组细胞的STAT1蛋白表达水平与空白对照组或阴性对照组比较均无统计学差异（均P＞0.05），而重组质粒pSTAT1-sh1和pSTAT1-sh2转染组的STAT1蛋白表达均明显低于空白对照组或阴性对照组，抑制率63%（均P＜0.05），见图3。

图1 重组质粒的DNA测序鉴定

3 讨论

STAT1是STAT家族中第1个被发现的成员，编码基因位于小鼠1号染色体上，相当于人2号染色体的q19至q33区，编码约750～795个氨基酸长度序列的蛋白质。STAT1最初是作为病毒感染中干扰素反应的胞质内介导子而被识别[2]。STAT1基因缺陷鼠受不同类型病原体攻击时会快速死亡；多种病毒包括水疱性口炎病毒（VSV）与鼠巨细胞病毒（MCMV）感染后，STAT1的表达起保护作用。相反，一些病原体如EB病毒已进化出利用STAT1活化而促进病原体复制的生存策略[3]。STAT1的生物学功能主要包括：（1）激活免疫系统：研究显示STAT1参与经MHCⅠ/Ⅱ加工与递呈抗原肽的全过程，包括表达多功能蛋白酶2（LMP2）、多功能蛋白酶7（LMP7）、抗原处理相关转运体1（TAP1），并通过MHCⅡ类分子反式激活因子（CIITA）间接激活MHC-Ⅰ/Ⅱ的表达。STAT1经诱导T-bet因子上调继而推动免疫球蛋白的类型转换。（2）抑制细胞生长：STAT1诱导周期蛋白依赖激酶（CDK）抑制子p21waf1/ CIP1、p27kip1的表达影响细胞增殖。同时，通过调节凋亡蛋白酶前体与Fas（CD95/APO-1）、p53等介入凋亡通路。

图2 Western blot检测重组质粒对STAT1蛋白表达水平的影响

在信号转导途径上，STAT1的上游刺激分子众多，包括干扰素类[4]、白介素类[5-8]、生长因子[5]、多种激素等，其活化的主要生化形式是第701位酪氨酸磷酸化，也包括乙酰化及甲基化形式[9]。STAT1自身作为转录因子之一，其下游靶基因众多。未激活状态下，STAT1可诱导免疫调控基因的组成性表达，如LMP2、TAP1、凋亡蛋白酶前体3等基因。STAT1的激活伴随趋化因子9（CXCL9）、周期蛋白依赖激酶抑制因子p21等分子上调。STAT1可与NF-κB协同诱导趋化因子10（IP10）和细胞间黏附因子1（ICAM1），协同转录因子Sp1诱导干扰素调节因子1（IRF1）等的表达。

笔者的前期筛查发现，STAT1上调是HIV-1急性或慢性感染患者中的高频事件，尚不清楚STAT1的持续性表达增高与HIV-1慢性免疫活化之间的关系。为进一步研究STAT1在HIV-1持续性感染中的分子机制，本研究构建了针对STAT1基因的 pGPU6/GFP/ Neo-shRNA表达载体。该系统的优点在于：（1）根据已知siRNA规则设计的shRNA片段，可直接连接酶切载体，无需修饰或过多酶切等步骤，降低分子重组中的不确定性。（2）初次克隆正确率＞60%，无需PCR或酶切筛选，可减少构建耗时及成本。（3）载体中含有GFP基因，在细胞内表达绿色荧光蛋白，通过荧光显微镜可确定重组质粒的转染效率。本研究中Western blot结果提示，重组质粒可有效干扰STAT1基因在TZM-bl细胞中的表达，可为进一步研究STAT1基因在HIV-1感染中的作用提供研究手段。

[1]Lambeth L S,Smith C A．Short hairpin RNA-mediated gene silencing[J]．Methods Mol Biol,2013,942:205-232．

[2]Horvath C M．STAT proteins and transcriptional responses to extracellular signals[J]．Trends Biochem Sci,2000,25(10):496-502．

[3]Najjar I,Fagard R．STAT1 and pathogens,not a friendly relationship[J]．Biochimie,2010,92(5):425-444．

[4]Donnelly R P,Sheikh F,Kotenko S V,et al．The expanded family of class II cytokines that share the IL-10 receptor-2(IL-10R2)chain [J]．J Leukoc Biol,2004,76(2):314-321．

[5]Subramaniam P S,Torres B A,Johnson H M．So many ligands,so few transcription factors:a new paradigm for signaling through the STAT transcription factors[J]．Cytokine,2001,15(4):175-187．

[6]Asao H,Okuyama C,Kumaki S,et al．Cutting edge:the common gamma-chain is an indispensable subunit of the IL-21 receptor complex[J]．J Immunol,2001,167(1):1-5．

[7]Sheikh F,Baurin V V,Lewis-Antes A,et al．Cutting edge:IL-26 signals through a novel receptor complex composed of IL-20 receptor 1 and IL-10 receptor 2[J]．J Immunol,2004,172(4):2006-2010．

[8]Yoshimoto T,Okada K,Morishima N,et al．Induction of IgG2a class switching in B cells by IL-27[J]．J Immunol,2004,173(4): 2479-2485．

[9]Kramer O H,Heinzel T．Phosphorylation-acetylation switch in the regulation of STAT1 signaling[J]．Mol cell Endocrinol,2010,315 (1-2):40-48．

Construction and validation of shRNA vectors targeting human STAT1

Objective To construct pGPU6 shRNA expression vector targeting human STAT1 gene and to evaluate its silencing effect in TZM-bl cell line．Methods The targeting sequences were designed and synthesized,and cloned into the pGPU6/GFP/Neo vector．After confirmation by DNA sequencing,the recombinant vectors were transfected into TZM-bl cells,and the expression levels of STAT1 were determined． Results Four shRNA clones were successfully constructed and confirmed by DNA sequencing．The transfected cells presented gene silencing effect and the protein expression of STAT1 was down-regulated by 63%．Conclusion We have successfully constructed STAT1-shRNA expression vector and its effect is validated in transfected TZM-bl cells．

RNA interference STAT1 ShRNA

2013-03-11）

（本文编辑：胥昀）

浙江省医药卫生科学研究基金项目（2012KYA060）

310006杭州，浙江省血液中心质量法规部（徐伶、虞容、杨劲、孟忠华），血库（陈峰）；浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室（杨宗兴）

孟忠华，E-mail:ywk@zjb.org.cn