胰岛素样生长因子－1受体在小鼠毛细胞发育过程中的表达

陈 冬 贺 欣 宫 亮 李 里 (辽宁医学院附属第一医院耳鼻咽喉科，辽宁 锦州 000)

胰岛素样生长因子－1受体在小鼠毛细胞发育过程中的表达

陈 冬 贺 欣1宫 亮 李 里2(辽宁医学院附属第一医院耳鼻咽喉科，辽宁 锦州 121000)

目的观察在小鼠耳蜗毛细胞中胰岛素样生长因子(IGF)-1受体(IGF1R)分布和表达情况，探讨其生物学特点。方法制作耳蜗组织铺片，采用荧光免疫组织化学染色方法，激光共聚焦显微镜观察小鼠发育期间(出生后P0-P20)的IGF-1R在耳蜗毛细胞的分布和定位。应用Western印迹及实时PCR法检测新生小鼠毛细胞在出生后不同时期IGF-1R蛋白及mRNA的表达水平。结果耳蜗组织铺片荧光免疫组织化学染色方法显示:IGF-1R在小鼠耳蜗发育过程中在毛细胞均有表达，部位在细胞膜上。随着年龄的增加表达减少。Western印迹及实时PCR显示小鼠耳蜗毛细胞的细胞膜蛋白及mRNA表达水平随着出生年龄增加而逐渐减少。P0组和P4组，P12组，P20组细胞膜蛋白及mRNA的表达水平相比具有明显差异(P＜0.05)，而P12和P20两组间比较无明显差异(P＞0.05)。结论在小鼠耳蜗发育成熟过程中在耳蜗毛细胞IGF-1R均有表达，表达量随着出生年龄增加而减少。推测在内耳细胞发育增殖过程中起重要信号转导作用。

胰岛素样生长因子受体;毛细胞;耳蜗

胰岛素样生长因子-1(IGF1)及其受体(IGF1R)促进细胞增殖并抑制凋亡，在组织器官及疾病发生发展中的作用是当前研究的热点。IGF1的生物学功能由其表面的特异性靶细胞受体IGF1R介导，在耳蜗的成熟发育过程中及协调组织器官内稳定中发挥重要作用。IGF1R在包括内耳毛细胞及支持细胞生长发育中受多种生长因子调控。IGF-1R对动物听觉感觉上皮和神经元的发育、分化及存活可能有一定的调节作用。IGF-1R在耳蜗的生长发育中的研究至今仍无报道。近年来IGF-1R在防护肿瘤及神经损伤方面应用广泛〔1，2〕，但其在耳蜗发育中的变化仍无相关报道。本研究将检测生长发育中的小鼠耳蜗IGF-1R的表达和定位分布特点，并探讨其生物学特性及意义。

1 材料与方法

1.1 材料 TRIZOL(Invitrogene，CA，USA)，Cy5-AffiniPure山羊抗鼠 IgG，Fcγ Subclass 1 Specific(Jackson，USA)，小鼠抗IGF-1R单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，实时PCR试剂盒(美国Qiagen公司)，图像采集应用美国BioRad公司的Molecular Imager VersaDoc MP Systems。

1.2 免疫组织化学染色法观察IGF-1R在耳蜗的表达 随机选取在出生后4 d(P4)，8 d(P8)的新生小鼠，每组8只(16耳)，制作的耳蜗组织铺片，滴加一抗IGF-1R(1∶500)，以及适当比例稀释的罗丹明鬼笔环肽和神经丝蛋白抗体(1∶100)，4℃过夜。PBS冲洗，5 min×3次。滴加荧光分子标记的混合二抗，两者以1∶1的比例混合。然后在室温下中孵育40 min，封片。激光共聚焦显微镜下观察IGF-1R在耳蜗毛细胞的分布和定位。

1.3 Western印迹法检测IGF-1R蛋白表达 随机选取4组在出生后不同时期0天(P0)，P4，12 d(P12)，20 d(P20)的新生小鼠，每组16只(32耳)，取小鼠耳蜗基底膜蛋白。Western印迹技术检测耳蜗基底膜IGF-1R蛋白:将总蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后(每一样本均含60μg总蛋白)，转印至硝酸纤维素膜上，采用增强化学发光(ECL)检测IGF-1R的表达。所用抗体为羊抗IGF-1R(Santa Cruz公司，稀释度为1∶500)及辣根过氧化物酶标记的马抗羊抗体(北京中山生物制品有限公司，稀释度为1∶1 000)。用IGF-1R的灰度值表示IGF-1R的相对表达水平。

1.4 实时PCR检测IGF-1R mRNA表达 随机选取4组在出生后不同时期 P0，P4，P12，P20的新生小鼠，每组16只(32耳)，提取小鼠耳蜗基底膜组织总RNA。将提取的1μg总RNA扩增成DNA目的片段。反应循环:95℃预变性5 min，94℃变性50 s，50℃退火 55 s，72℃延伸 1 min，40 个循环。4℃保存。IGF-1R引物序列参照文献:上游引物:5'-GCT GAG CTG GTG GACGCT CT AG-3';下游引物:5'-AAT GTT TAC TTG TGT ATT TCA TTG-3';目的片段为208 bp;内参β-actin上游引物:5'-CTCCTCTTGCTCGAAGTCTC-3';下游引物5'-TCGATGTCGAAGACCTTCAACA-3';目的片段为201 bp。PCR产物琼脂糖凝胶电泳、紫外分析仪观察、照相，应用图文分析系统进行分析，IGF-1R与β-actin的灰度比值表示IGF-1R的相对表达水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件包，组间差异比较用单因素方差分析。

2 结果

2.1 荧光免疫组化观察IGF-1R小鼠耳蜗HC的表达 一抗、二抗孵育后，激光共聚焦显微镜下观察，IGF-1R抗体结合部位发出绿色荧光。小鼠耳蜗HC细胞有IGF-1R表达，主要分布于细胞膜。IGF-1R在P0、P4、P12和P20小鼠耳蜗铺片毛细胞中的表达量随着出生年龄增加而逐渐减少。见图1。

2.2 IGF-1R蛋白及mRNA在小鼠耳蜗HC的表达检测 随着出生年龄增加，小鼠耳蜗毛细胞的IGF-1R蛋白和mRNA表达水平逐渐减少。P0组和P4组，P12组，P20组差异具有统计学意义(P＜0.05)，P4组和P12组，P20组差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

图1 IGF-1R在不同出生年龄小鼠耳蜗铺片HC中的分布状态

表1 IGF-1R蛋白和mRNA在各组小鼠的耳蜗基底膜组织中的表达(±s，n=32)

表1 IGF-1R蛋白和mRNA在各组小鼠的耳蜗基底膜组织中的表达(±s，n=32)

与P0组比较，2)与P4组比较:均P＜0.05

组别 IGF-1R/β-actin IGF-1RmRNA/β 1.93±0.51 1.97±0.61 P4组 1.43±0.441) 1.59±0.761)P12组 0.54±0.211)2) 0.64±0.411)2)P20组 0.39±0.091)2) 0.58±0.221)2)-actin P0组

3 讨论

IGF-1R和胰岛素有同源性。其是一种酪氨酸蛋白受体，可以与IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ结合。结合后将使细胞内的酪氨酸激酶激活，从而激活细胞内信号传导通路，促使细胞分裂分化以及组织器官的生长发育成熟。IGF-IR能够发挥有丝分裂原作用，可以调控细胞分裂分化和增殖。对脑的发育以及神经系统损伤修复起到重要作用〔3～6〕。

本研究结果表明IGF-1R在小鼠耳蜗的成长发育过程中发挥重要作用。随着耳蜗发育的逐渐成熟其表达下调，调控能力下降。IGF-1R与IGF-I结合后，激活信号转导通路。IGF-1R的表达与IGF-I密切相关。IGF-1可由体内很多组织器官分泌，如肝脏分泌循环中IGF-1，生长激素/IGF-1轴(HG/IGF-1 Raxis)调节其表达〔7，8〕。IGFBP是一组和IGF-1R具有高度亲和力的蛋白质，已发现10种IGFBP，已成功克隆IGF-1R-6。IGFBP调节IGF-1R水平从而影响其生物效应。

IGF-1R与IGF-1结合后调控中枢神经系统发育的全过程，维持调节神经元的增生，分化及营养神经功能。在神经细胞培养方面的研究表明:在IGF-1培养液中生长的神经细胞数量是正常培养的数十倍。在有神经损伤的大鼠模型中研究表明:在损伤后第3天在受累脑组织区域IGF-1和IGF-1R mRNA的表达量明显增加增加〔9，10〕。IGF-1R目前在肿瘤学及神经损伤方面已进行研究，IGF-1R有望成为治疗神经损伤疾病的新靶点。但目前IGF-1R在耳聋保护的作用机制尚未完全清楚。

1 Murillo-Cuesta S，Rodríguez-de la Rosa L，Cediel R，et al.The role of insulin-like growth factor-I in the physiopathology of hearing〔J〕.Front Mol Neurosci，2011;4:11-6.

2 Michel Goedert.Tau protein and the neurofibrillary pathology of deafness〔J〕.TINS，1993;16(11):460-5.

3 Dupraz S，Grassi D，Karnas D，et al.The insulin-like growth factor 1 receptor is essential for axonal regeneration in adult central nervous system neurons〔J〕.PLoSOne，2013;8(1):e54462-71.

4 Fahrenholtz CD，Beltran PJ，Burnstein KL.Targeting IGF-IR with ganitumab inhibits tumorigenesis and increases durability of response to androgen-deprivation therapy in VCaP prostate cancer xenografts〔J〕.Mol Cancer Ther，2013:24(1):234-8.

5 Singh I，Amin H，Rah B.Targeting EGFR and IGF 1R:a promising combination therapy for metastatic cancer〔J〕.Front Biosci，2013;5(2):231-46.

6 Fujita M，Takada YK，Takada Y.Insulin-like growth factor(IGF)signaling requires αvβ3-IGF1-IGF type-1 receptor(IGF1R)ternary complex formation in anchorage-independence and the complex formation does not require IGF1R and Src activation〔J〕.J Biol Chem，2012:14(2):456-61.

7 Gerdes HH，Kaether C.Green fluorescent protein:applications in cell biology〔J〕.FEBS Lett，1996;389:44-7.

8 Magarios M，Aburto MR，Sánchez-Calderón H，et al.RAF kinase activity regulates neuroepithelial cellproliferation and neuronal progenitor cell differentiation during early inner ear development〔J〕.PLoS One，2010;5(12):e14435-41.

9 Baulac S，LaVoie MJ，Kimberly WT，et al.Functional gamma-secretase complex assembly in Golgi/trans-Golgi network:interactions among IGF〔J〕.Neurobiol Dis，2003;14:194-204.

10 Price DL，Wong PC，Markowska AL，et al.The value of transgenic models for the study of neurodegenerative diseases〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2000;920:179-91.

The expression of IGF-1R in hair cells of normal developingm ice

CHEN Dong，HE Xin，GONG Liang，et al.
Ear Nose Throat Department，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，Liaoning，China

ObjectiveTo study the expression and distribution of IGF-1R of the inner ear in normal developingmice，and to elucidate the function and biological characteristics of IGF-1R.MethodsThe expression and distribution of IGF-1R of the inner ear during normal developing(P0-P20 after birth)micewas observed by fluorescence immunohistochemistry with laser scanning confocalmicroscope.IGF-1R protein andmRNA was examined byWestern blotand realtime PCR.ResultsIn the hair cell of cochlea，themRNA expressions of IGF-1R detected by in situ hybridization were almost the same as the protein expressions of IGF-1R tested with immunohistochemicalmethods.The IGF-1R was widely distributed in the cellmembrane of hair cells.The protein and mRNA expression of IGF-1R in hair cells and the quantity of expression decreased with aging.ThemRNA expression of IGF-1R in group P0 was higher than that in group P4，P12 and P20(P＜0.01)，and there was no significant difference between group P12 and group P20(P＞0.05).ConclusionsThere are expressions of IGF-1R in hair cells in normal developingmice.The expressions are related to ages and decrease with aging.IGF-1Rmay play an important role in signal transduction during inner ear cell proliferation in a paracrine and autocrinemanner.

Insulin-like growth factor receptor;Hair cells;Cochlea

R76

A

1005-9202(2013)12-2808-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.034

辽宁省教育厅高等学校科研项目(No.2009A460)

1 辽宁医学院附属第一医院心内科 2 辽宁医学院附属第一医院儿科

陈 冬(1972-)，男，博士，副教授，副主任医师，主要从事耳鼻咽喉科相关疾病研究。

〔2012-11-19收稿 2013-02-27修回〕

(编辑 张海彬)